四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室魏于全教授、鞏長旸研究員和姚少華研究員團隊于2017年1月在ACS Nano（影響因子：13.903）發(fā)表文章“Artificial Virus Delivers CRISPR-Cas9 System for Genome Editing of Cells in Mice”（點擊下方二維碼即可閱讀原文）。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。經(jīng)過科學(xué)家們的一系列改造以后，CRISPR/Cas9成為新一代基因編輯工具，可以對靶基因進行特定修飾，具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前，其體內(nèi)應(yīng)用仍存在諸多問題，也使其臨床轉(zhuǎn)化受到局限。
為了解決CRISPR/Cas9系統(tǒng)體內(nèi)遞送遇到的難題，華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室魏于全教授、鞏長旸研究員和姚少華研究員設(shè)計并構(gòu)建了一種新型的人工病毒基因載體用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的體內(nèi)遞送。該人工病毒的設(shè)計受天然病毒“核-殼”結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，由具有帶正電的氟化小分子聚乙烯亞胺內(nèi)核（PF33）和多功能的高分子外殼（RGD-R8-PEG-HA）組成。其中，內(nèi)核能夠?qū)^大的CRISPR/Cas9質(zhì)粒（>10 kb）進行高效負載，并對腫瘤細胞進行高效率轉(zhuǎn)染，同時保護質(zhì)粒逃逸溶酶體的降解。RGD-R8-PEG-HA高分子外殼帶負電，可以掩蔽內(nèi)核正電荷，使人工病毒在血液中更加穩(wěn)定，保護核酸避免被免疫系統(tǒng)清除；PEG賦予人工病毒系統(tǒng)更長的體內(nèi)循環(huán)時間；RGD和HA可靶向腫瘤高表達的整合素αvβ3和CD44受體，增加人工病毒在腫瘤部位的富集；R8可以增加腫瘤滲透深度，并提高腫瘤細胞攝?。煌瑫r腫瘤細胞溶酶體的透明質(zhì)酸酶可以降解外殼中的HA，暴露出帶正電荷的內(nèi)核，促進溶酶體逃逸，增強基因編輯效率。
體外轉(zhuǎn)染實驗表明人工病毒的轉(zhuǎn)染效率明顯高于商用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000，且在有血清干擾情況下，其轉(zhuǎn)染效率依然較高。當選擇卵巢癌病人腫瘤組織高表達的MTH1基因作為治療靶點時，人工病毒可遞送CRISPR/Cas9成功敲除卵巢癌細胞中的MTH1基因，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡，抑制卵巢癌細胞增殖。在卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移動物模型的治療中，人工病毒可在腫瘤部位大量富集，并高效轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，使腫瘤部位的MTH1蛋白表達降低，凋亡增加，最終顯著抑制了小鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，且具有較低的脫靶風(fēng)險 (圖1)。
圖1 本研究圖示
專家點評
錢志勇教授：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代的基因編輯技術(shù)，已經(jīng)成為從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用領(lǐng)域非常具有潛力的基因編輯工具。但因需要編碼核酶和sgRNA， CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的質(zhì)粒較大，一般大于10 kb，因此對其轉(zhuǎn)染系統(tǒng)提出了較高要求。目前CRISPR/Cas9質(zhì)粒常用的體內(nèi)遞送方式主要有水動力高壓注射和病毒遞送等方法。前者在注射時會造成瞬時血壓升高，可能造成器官損傷，在人體內(nèi)很難應(yīng)用；而病毒遞送可能會遇到基因組整合、免疫原性等問題，具有潛在的風(fēng)險，亟待開發(fā)新型遞送系統(tǒng)。魏于全教授、鞏長旸研究員和姚少華研究員團隊受到天然病毒結(jié)構(gòu)啟發(fā)，創(chuàng)新性地設(shè)計并構(gòu)建了可以高效轉(zhuǎn)染超大質(zhì)粒（>10 kb）的人工病毒基因載體，在體內(nèi)外遞送CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)小鼠體內(nèi)高效基因編輯，并在腫瘤模型中取得了良好的治療效果。該研究為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)應(yīng)用提供了理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)，也為超大質(zhì)粒的體內(nèi)遞送提供了潛在新選擇。
錢志勇，博士，四川大學(xué)二級教授，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物研究室/生物治療國家重點實驗室教授、博士生導(dǎo)師，國家杰出青年基金獲得者、國家“萬人計劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會納米生物技術(shù)分會主任委員，擔任Materials Express、J Biomed Nanotechnol等學(xué)術(shù)期刊主編，擔任Chinese Chemical Letters、J Biological Engineering副主編。針對納米生物材料的構(gòu)建及其在腫瘤治療和組織修復(fù)中的應(yīng)用進行了長期的研究，目前已經(jīng)在Chem Soc Rev、Adv Funct Mater、Adv Sci、ACS Nano、Nano Lett、Biomaterials等學(xué)術(shù)期刊以通訊作者發(fā)表SCI論文100余篇。
作者投稿心得
CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是研究前沿，目前在疾病動物模型構(gòu)建、體外功能和機制研究方面有較多報道。但其體內(nèi)應(yīng)用，特別是疾病治療方面報道較少。由于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的質(zhì)粒較大（>10 kb），其轉(zhuǎn)染效果較低。本文作者針對這一難題，查閱了大量文獻，并創(chuàng)新性地設(shè)計并構(gòu)建了可高效遞送超大質(zhì)粒的人工病毒基因遞送系統(tǒng)，實現(xiàn)了體內(nèi)靶向和高效基因編輯，并在腫瘤模型治療中取得了較好的治療效果。本文發(fā)表于納米領(lǐng)域著名期刊ACS Nano，該期刊對論文的創(chuàng)新性有非常高的要求，投稿的文章約只有20%可以送外審。本文歷經(jīng)五輪修改，十余名審稿專家給出了非常有建設(shè)性的意見，作者針對審稿專家的意見，補充相應(yīng)實驗驗證，最終得到了所有審稿專家的認可。
共同通信作者
魏于全，教授，博士生導(dǎo)師，2003年當選中國科學(xué)院院士；原四川大學(xué)副校長，華西醫(yī)院臨床腫瘤中心主任與生物治療國家重點實驗室主任，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會理事長，國家生物治療協(xié)同創(chuàng)新中心負責人，國家綜合性新藥研究開發(fā)技術(shù)大平臺負責人， Signal Transduction and Targeted Therapy共同主編、Human Gene Therapy 副主編、Current Molecular Medicine副主編；科技部“973” 項目首席科學(xué)家，國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體負責人，教育部“長江學(xué)者獎勵計劃”特聘教授，1997 年國家杰出青年科學(xué)基金獲得者，國家“百千萬人才工程”第一、二層次人選，十五“863” 生物與農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域生物工程技術(shù)主題專家組組長，十二五“863” 生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物技術(shù)藥物主題專家組成員、原中華醫(yī)學(xué)會副會長、原教育部科學(xué)技術(shù)委員會生物醫(yī)學(xué)學(xué)部常務(wù)副主任。主要從事腫瘤生物治療的基礎(chǔ)研究、關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)、產(chǎn)品研發(fā)及臨床治療等，有關(guān)腫瘤微環(huán)境、免疫治療、基因治療與靶向藥物等相關(guān)研究結(jié)果已在多種國際雜志上發(fā)表SCI論文300多篇。
共同通信作者
鞏長旸，博士，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室/生物治療國家重點實驗室研究員、博士生導(dǎo)師，國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金獲得者，入選主持中組部“萬人計劃”青年拔尖人才支持計劃，四川省衛(wèi)生和健康委員會學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人，中國抗癌協(xié)會青年理事會理事，中國生物材料學(xué)會納米生物材料分會委員會委員，中國病理生理學(xué)會免疫學(xué)專業(yè)委員會委員，中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會造影技術(shù)分會委員會委員，中國抗癌協(xié)會納米腫瘤學(xué)分會青年委員會委員，中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會納米醫(yī)學(xué)與工程學(xué)分會青年委員會委員，中國生物物理協(xié)會納米生物學(xué)分會青年委員會委員。主要研究領(lǐng)域為針對腫瘤治療的新型自組裝基因、疫苗和藥物遞送系統(tǒng)，以通訊或第一作者在Adv Mater、Adv Funct Mater、ACS Nano、Biomaterials等國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI論文80余篇。
共同通信作者
姚少華，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。主要研究方向是應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進行基因功能和基因治療研究；側(cè)重于發(fā)展基于非病毒載體的CRISPR導(dǎo)入系統(tǒng)以及開發(fā)基于CRISPR/Cas9的新型基因編輯工具，集中于肝臟相關(guān)的腫瘤和遺傳病的發(fā)病機制、基因治療研究。多項研究結(jié)果發(fā)表在JBC、ACS Nano、Human Gene Therapy、Neoplasia、Lab Invest等期刊。近年來，主持多項國家自然科學(xué)青年基金、面上項目、863計劃重點項目以及橫向課題等項目。
共同第一作者
博士研究生李玲、宋林江、楊茜和劉小威為該論文的共同第一作者。
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本文編輯：張 敏
本文排版：陳紅梅 張洪雪