【摘要】 目的 探討骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）對室管膜前下區(qū)（anterior subventricular zone，SVZa）神經(jīng)干細胞DLX5表達的影響?！》椒ā◇w外培養(yǎng)SVZa神經(jīng)干細胞，用BMP-2及其拮抗劑Noggin誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細胞，分別用免疫熒光染色和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測DLX5表達變化。 結(jié)果 BMP-2組SVZa神經(jīng)干細胞DLX5蛋白表達和DLX5mRNA表達水平明顯高于對照組（Plt;0.05），且該效應(yīng)能被其拮抗劑Noggin特異性地抑制?！〗Y(jié)論 BMP-2是DLX5上游調(diào)節(jié)基因，可促進SVZa神經(jīng)干細胞DLX5的表達。【Abstract】 Objective To investigate the effect of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)on expression of DLX5 of neural stem cells in anterior subventricular zone (SVZa). Methods The neural stem cells of SVZa were separated and cultured in vitro, which were induced by BMP-2 and Noggin.Immunofluorescence staining and RT-PCR were employed to assay the expression of DLX5. Results The percentages of expression of DLX5 protein and DLX5 mRNA in BMP-2 group were much higher than those in the control group (Plt;0.05). And this induction could be specifically blocked by Noggin. Conclusion BMP-2 is an upstream gene of DLX5; BMP-2 can promote the expression of DLX5 of the neural stem cells of SVZa.
目的 觀察以纖維蛋白膠（fibrin sealant，F(xiàn)S ）為載體復(fù)合骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)的注射型骨修復(fù)材料對體外培養(yǎng)的兔骨髓基質(zhì)細胞（marrow stromal cells， MSCs）增殖和分化的影響，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法 取3日齡新西蘭兔骨髓進行培養(yǎng)傳代，采用第3代細胞進行研究。實驗分為3組，實驗組：以含1 μg/ml rhBMP-2注射型FS培養(yǎng)細胞；FS對照組：以單純FS培養(yǎng)細胞；空白對照組：不作任何處理。采用細胞培養(yǎng)、組織化學及電鏡等方法對各組兔MSCs的增殖、貼壁率、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性及染色、Ⅰ型膠原表達、超微結(jié)構(gòu)及細胞在材料中的生長情況進行觀察。 結(jié)果 各組細胞促增殖作用由強到弱依次是：FS對照組→實驗組→空白對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；對細胞貼壁率的影響總體由強到弱依次是：FS對照組→實驗組→空白對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。各組ALP活性由強到弱依次是：實驗組→FS對照組→空白對照組，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；各組細胞的Ⅰ型膠原表達水平由高到低依次是：實驗組→FS對照組→空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。 掃描電鏡觀察，材料表面粗糙，有微孔存在，F(xiàn)S對照組、實驗組細胞與材料融合生長。透射電鏡觀察：實驗組細胞向成骨細胞分化程度高，但細胞增殖活性較FS對照組稍差；FS對照組細胞向成骨細胞分化的程度較實驗組低，細胞增殖活性較好；空白對照組的細胞增殖活性較差，胞外基質(zhì)少。 結(jié)論 以FS為載體復(fù)合BMP的注射型骨修復(fù)材料可顯著提高MSCs向成骨細胞方向的分化水平，但對MSCs促增殖作用不明顯。
目的 以聚乳酸／聚羥基乙酸（poly-lactide-co-glycolide，PLGA）為載體，探討重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方面的作用及可行性。方法 將PLGA制成直徑4 mm，厚3 mm的圓柱形，與rhBMP-2復(fù)合（0.5 mg/塊），制備PLGA-rhBMP-2復(fù)合物。選取2月齡新西蘭兔，抽取骨髓行原代及傳代培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為2×10.7/ml，與PLGA共培養(yǎng)24 h，制備PLGA細胞復(fù)合物。另取2月齡新西蘭兔72只，于雙側(cè)髕股關(guān)節(jié)股骨髁部制備直徑4 mm、深達髓腔的缺損。其中36只兔右側(cè)缺損處植入PLGA-rhBMP-2復(fù)合物，為實驗組；左側(cè)植入PLGA，為單純載體組；另36只兔左側(cè)缺損不作任何處理，為空白對照組，右側(cè)缺損處植入PLGA-細胞復(fù)合物，作為細胞組。術(shù)后4、8、12、24、36和48周取材，行大體、組織學觀察以及組織學評分。結(jié)果術(shù)后動物均存活。術(shù)后4周，實驗組和細胞組缺損內(nèi)被半透明組織填充，觸之柔軟，表面較光滑，軟骨細胞周圍基質(zhì)異染弱，新生軟骨厚度較正常軟骨厚；空白對照組和單純載體組未見明顯組織形成。8周，實驗組和細胞組內(nèi)新生組織呈白色，半透明，質(zhì)較韌，表面平整，與周圍正常軟骨界限模糊；新生軟骨細胞分布均一，但仍較正常軟骨厚，PLGA已大部分降解，僅遺留少量顆粒；單純載體組和空白對照組缺損明顯，底部形成少量白色膜狀組織。12、24周，實驗組和細胞組缺損內(nèi)完全充填白色半透明新生軟骨組織，質(zhì)韌，表面平整，與正常軟骨界限消失，厚度接近正常軟骨，與正常軟骨連接良好，表面細胞平行排列，深層有縱向排列的傾向，呈團狀，陷窩形成，但有別于正常軟骨細胞；單純載體組和空白對照組缺損邊緣及底部形成少量軟骨細胞，大部分為纖維組織。 36、48周，實驗組和細胞組新生軟骨組織色稍發(fā)白，表面連續(xù)，欠平整，與正常軟骨界限消失，未見滑膜增生; 新生軟骨厚度較正常軟骨薄，軟骨細胞周圍基質(zhì)異染較弱；單純載體組及空白對照組缺損仍存在，但較以前縮小，基底形成纖維組織，髁部可見部分軟骨面不平整、剝脫，部分軟骨下骨外露，滑膜增厚。組織學評分，實驗組和細胞組術(shù)后12、24周分別與4、 8和48周比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各時間點實驗組、細胞組分別與單純載體組和空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），實驗組與細胞組在各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 PLGA-rhBMP-2復(fù)合物在降解過程中釋放出rhBMP-2，rhBMP-2作用于缺損局部的骨髓基質(zhì)細胞，誘導(dǎo)其向軟骨細胞分化，從而修復(fù)軟骨缺損；此方法簡便易行，有實用價值，有望成為治療軟骨缺損的一種新方法。
目的 通過研究大鼠股骨干骨折合并腦外傷時骨痂組織內(nèi)骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）表達水平的變化，探討腦外傷對骨折愈合的影響及作用機制。 方法 取12周雄性SD大鼠32只，體重368±25 g。隨機分成4組，每組8只：A組為骨折合并腦外傷1周組，B組為單純骨折1周組，C組為骨折合并腦外傷2周組，D組為單純骨折2周組。A、C組制作腦外傷和股骨干骨折模型，B、D組制作單純股骨干骨折模型作對照。各組攝X線片后截取骨痂，行HE染色觀察骨痂生長情況及其組織形態(tài)，免疫組織化學染色測定BMP-2表達，RT-PCR檢測BMP-2 mRNA水平。結(jié)果 X線片示A組骨折端有較少量骨痂形成，骨折線較清晰；B組骨折線清晰；C組骨折端有較多骨痂形成，骨折線已模糊；D組僅有少量骨痂形成，骨折線較清晰。HE染色A組可見較多早期軟骨細胞、成纖維細胞；B組骨折間隙可見成纖維細胞，僅夾雜有少量的早期軟骨細胞；C組骨折端有新生骨小梁長入；D組未見有骨小梁形成。免疫組織化學染色可見成纖維細胞、間充質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、早期軟骨細胞、成骨細胞胞漿均出現(xiàn)廣泛的強陽性反應(yīng)，A組陽性細胞數(shù)量多于B組，并且顯色強；C組陽性細胞數(shù)量多于D組，并且顯色強。分析顯示A、C組平均陽性細胞百分數(shù)為0.762%±0.052%、0.756%±0.079%，分別高于同一時間點B、D組的0.702%±0.052%、0.672%±0.044%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RT- PCR分析顯示：A～D組骨痂BMP-2 mRNA 含量依次遞減，A、C組骨痂BMP-2 mRNA 含量為1.07±0.13、0.78±0.11，均顯著高于同一時間點B、D組的0.91±0.12、0.61±0.08，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論 腦外傷對骨折愈合有促進作用，可能與腦外傷后BMP2表達水平升高有關(guān)。
目的 探討自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)活性多肽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）體外定向誘導(dǎo)成骨的能力，評價BMP-2活性多肽的成骨誘導(dǎo)性及誘導(dǎo)成骨的劑量依賴性 方法取4周齡Wistar大鼠分離培養(yǎng)MSCs，傳至第3代時改用條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別加入濃度為300、200、100、50及0 μg/ml的BMP2活性多肽，并依次記為A、B、C、D和E組。細胞培養(yǎng)至5、10、15及20 d，檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，測定鈣含量，采用實時熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)QPCR)檢測Ⅰ型膠原、骨橋蛋白 (osteopontin，OPN) 及骨鈣素（osteocalcin，OCN） mRNA的表達，檢測不同濃度BMP2活性多肽體外誘導(dǎo)成骨的能力。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后，培養(yǎng)細胞由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?。隨條件培養(yǎng)基中BMP-2活性多肽濃度的增加，細胞發(fā)生成骨樣改變的時間提前。ALP活性和鈣含量檢測顯示，A組和B組較其他組增加明顯，且差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A、B組間比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。FQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度條件培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，Ⅰ型膠原、OPN和OCN mRNA在各組均有表達。Ct值表明其表達量的大小順序為A、B、C、D組，E組無表達，A組和B組的Ct值明顯大于C組和D組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。結(jié)論 BMP-2活性多肽能有效地促進MSCs向成骨方向分化，其誘導(dǎo)作用存在劑量依賴關(guān)系，最佳誘導(dǎo)劑量為200 μg/ml。
目的 檢測重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）與納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nano-hydroxyapatite/collagen/ polylactic acid, nHAC/PLA）復(fù)合后形成的活性nHAC/PLA（active nHAC/ PLA, AnHAC/PLA）修復(fù)顱骨極限缺損的效果。方法 新西蘭大白兔48只，體重2.0~2.5 kg。制備直徑為15 mm的顱骨全層缺損模型，隨機分成4組，每組12只。陽性對照組：缺損區(qū)植入自體髂骨；空白對照組：缺損區(qū)不植入任何材料；陰性對照組：缺損區(qū)植入nHAC/PLA；實驗組：缺損區(qū)植入AnHAC/PLA，每塊AnHAC/PLA上平均吸附rhBMP-21.431 mg。術(shù)后8、16周通過比較顱骨缺損區(qū)X線阻射面積占總?cè)睋p面積百分比、HE染色和Masson’s三色法染色觀察顱骨極限缺損的修復(fù)情況。結(jié)果；術(shù)后8、16周，各組顱骨缺損區(qū)X線阻射程度，陽性對照組分別為67.21%±2.06%、86.48%±1.73%，空白對照組分別為5.84%±1.92%、9.48%±2.72%，陰性對照組分別為19.13%±2.51%、3567%±3.28%，實驗組分別為58.84%±2.55%、85.61%±3.36%。其中除16周實驗組與陽性對照組以及空白對照組8、16周比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)外，其余各組各時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組織學觀察顯示,陽性對照組骨缺損區(qū)16周骨小梁較8周增寬，被大量骨組織充填；空白對照組8、16周骨缺損區(qū)均被纖維組織充填，無新骨生成；陰性對照16周骨缺損區(qū)為剩余材料與纖維組織充填，周邊新骨較8周形成增多；實驗組8周材料植入?yún)^(qū)為新生骨替代，16周新生骨呈板層狀，缺損區(qū)材料殘留較少，且周圍可見較多成骨細胞。結(jié)論 nHAC/PLA是rhBMP-2的良好載體，兩者復(fù)合后制備的AnHAC/PLA具有良好骨形成能力，有望應(yīng)用于臨床上修復(fù)較大型骨缺損。
目的 構(gòu)建含有人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4，hBMP-4)的非復(fù)制型腺病毒表達載體pAdE/hBMP-4并檢測其表達。 方法 酶切質(zhì)粒pCS2(+)/hBMP-4獲得目的基因片段，克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)，再亞克隆至pShuttle-CMV，電轉(zhuǎn)化至含有pAdEasy-1骨架質(zhì)粒的E.coli BJ5183/p中進行同源重組，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝成含有hBMP-4基因的非復(fù)制型腺病毒。病毒顆粒感染HEK293和HeLa細胞，提取總RNA和總蛋白，進行RT-PCR和Western- blot檢測。結(jié)果 獲得了含有目的基因hBMP-4的非復(fù)制型腺病毒表達載體pAdE/hBMP-4，酶切鑒定提示構(gòu)建正確，RT-PCR檢測到hBMP-4基因的轉(zhuǎn)錄，Western- blot檢測到hBMP-4蛋白表達。 結(jié)論 將目的基因hBMP-4克隆至非復(fù)制型腺病毒表達載體中，為進一步研究其在基因治療骨缺損中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
目的 在體外運用人骨形成蛋白7(human bone morphogeneticprotein 7,hBMP7)基因重組35 型腺病毒(recombinant adenovirus’s containing fibers derived from Bgroup serotype 35，rAd5/F35) 誘導(dǎo)大鼠脂肪源性干細胞（adiposederived adult stem cell, ADASC）向成骨細胞定向分化，為骨組織工程探索新的細胞來源。 方法 以pcDNA1.1/氨芐青霉素-hBMP-7質(zhì)粒為模板擴增hBMP-7基因，將回收的PCR產(chǎn)物片段克隆入pDC316載體，獲得重組質(zhì)粒pDC316-hBMP-7。骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35和穿梭質(zhì)粒pDC316-hBMP-7共轉(zhuǎn)染293細胞，同源重組產(chǎn)生rAd5/F35-hBMP-7。同樣的方法構(gòu)建rAd5/F35增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)。在體外分別轉(zhuǎn)染大鼠ADASC并留置空白對照。觀察細胞形態(tài)和生長情況，ELISA檢測轉(zhuǎn)染基因的轉(zhuǎn)錄和表達，檢測鈣結(jié)節(jié)和骨鈣素等成骨細胞表型。 結(jié)果 PCR、酶切鑒定表明rAd5/F35－h(huán)BMP-7質(zhì)粒構(gòu)建正確。rAd5/F35-EGFP對大鼠ADASC中轉(zhuǎn)染效率可達90%以上，hBMP-7基因存在于轉(zhuǎn)染后的ADASC中并表達相應(yīng)的蛋白，誘導(dǎo)組鈣結(jié)節(jié)形成，電鏡見胞質(zhì)中有鈣質(zhì)成分，堿性磷酸酶陽性，骨鈣素表達增強。 結(jié)論 rAd5/F35介導(dǎo)hBMP-7基因可促進ADASC向成骨細胞定向分化。
目的 觀察重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2）與骨誘導(dǎo)劑對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞 (mesenchymalstem cells, MSCs)的增殖與成骨作用。 方法 體外培養(yǎng)大鼠MSCs，分為實驗組與對照組。對照組：不加rhBMP-2與骨誘導(dǎo)劑。實驗組：骨誘導(dǎo)劑單獨作用于SD大鼠MSCs（A組）；rhBMP-2分別以濃度為10（B組）、50 (C組)、100 (D組)、200 μg/L (E組)單獨作用于SD大鼠MSCs；rhBMP-2分別以濃度為10 (F組)、50 (G組)、100 (H組)、200 μg/L(I組)聯(lián)合骨誘導(dǎo)劑作用于SD大鼠MSCs。測定第3、6、9、12天的增殖狀況（MTT法）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和骨鈣素（osteocalcin,OC）水平。 結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察SD大鼠MSCs原代培養(yǎng)時，細胞接種12 h后即可貼壁；48 h細胞成梭形，形似成纖維細胞；4 d時細胞為多角形、紡錘形；6 d時，成纖維細胞散在分布，少量呈集落樣生長，為漩渦狀、放射狀排列；10 d左右，細胞基本鋪滿瓶底，融合成片。傳代細胞5～7 d即可長滿瓶底。各時間點A~I組均能顯著促進MSCs成骨活性（ALP和OC）的表達。B~E組同時具有促進MSCs 增殖作用，并呈濃度依賴性；F~I組增殖及ALP、OC含量均高于A~E組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論 rhBMP-2與骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合作用可在促進MSCs增殖的同時提高其成骨活性。
目的 比較采用自體髂骨、自體骨椎間融合器和骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）人工骨椎間融合器椎間融合治療成人腰椎滑脫的效果。 方法 1997年1月～2004年1月，收治114例腰椎滑脫患者。男45例，女69例；年齡32～61歲，平均43歲。其中Ⅰ度滑脫85例，Ⅱ度滑脫24例，Ⅲ度滑脫5例?；颊呔凶倒葆敼潭?、后路椎間融合術(shù)，根據(jù)椎間融合材料的不同，將患者分為A組（自體髂骨椎間融合，42例）；B組（自體骨/單枚椎間融合器，36例）；C組（BMP人工骨/單枚椎間融合器，36例）。比較術(shù)后三組患者的手術(shù)時間、術(shù)中出血量、臨床療效、融合率和手術(shù)節(jié)段椎間隙高度的變化。 結(jié)果 術(shù)后患者均獲隨訪13～30個月，平均15個月。三組手術(shù)時間、術(shù)中出血量及術(shù)前椎間隙高度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。最后隨訪時，A、B及C組臨床療效評估優(yōu)良率分別為81.0%、80.6%及83.3%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后1年，椎間融合率分別為81.0%、83.3%及97.0%，A、B組與C組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；椎間隙高度丟失A組與B、C組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論 BMP人工骨椎間融合器作為腰椎滑脫后路椎間融合的植骨材料，術(shù)后融合率高，椎間隙高度丟失少，臨床療效好，優(yōu)于自體髂骨和自體骨椎間融合器。