引用本文： 胡小娟, 曼古努·石那别克, 胡昕, 于敏杰, 闫芳. 去整合素金属蛋白酶33对气道血管内皮细胞增殖和管腔形成的影响及作用机制. 中国呼吸与危重监护杂志, 2024, 23(8): 569-574. doi: 10.7507/1671-6205.202404057 复制
支气管哮喘（简称哮喘）的病因和发病机制复杂，气道炎症反应、气道高反应性及气道重塑为其三大特征。气道重塑是指包括细支气管在内的一系列气道形态学改变，涵盖了上皮、基底膜、平滑肌和血管在内的气管壁全层[1]。研究发现无论成人还是儿童哮喘中存在气道粘膜下层和固有层微血管数量的增加，并与疾病严重程度相关[2]。由此可见，哮喘气道重塑的进程还包括气道血管的再生和重塑。去整合素金属蛋白酶33（adisintegrin and metalloproteinase，ADAM33）是ADAM家族成员之一，已被确定为哮喘易感基因[3]。研究证实ADAM33可从促进气道上皮细胞间充质转化[4]、调控成纤维细胞分化和增殖[5]、改变气道平滑肌细胞增殖能力和机械行为[6]、调节气道新生血管生成[7]等多个方面参与哮喘气道重塑。课题组先前研究结果表明轻至重度的哮喘患者都存在气道血管重塑，ADAM33的表达水平与哮喘患者气道血管重塑的严重程度密切相关；且ADAM33的异常表达能够调控气道VSMCs的表型变化，在气道血管重塑中发挥作用[8]。VECs同样是气道血管重塑和血管形成的主要效应细胞，与VSMCs在结构上相邻，在功能上交互调控。VECs的细胞膜上大量受体可探测周围环境的变化，通过一定的信号转导机制将各种刺激信号转导至细胞内[9]。VECs自身ADAM33 mRNA表达水平很低，有研究发现可溶性ADAM33（sADAM33）在体外能快速诱导内皮细胞分化，诱导新生血管形成[10]。本研究通过气道VSMCs和VECs共培养实验，探讨sADAM33的表达对VECs增殖和管腔形成的影响及可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验细胞
人肺微血管内皮细胞（Human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）、人气道平滑肌细胞 （Human airway smooth muscle cells，HASMC）来源于普诺赛生物有限公司，分别使用专用培养基培养，培养环境：37℃，5% CO2，饱和湿度。
1.1.2 试剂与抗体
阴性对照病毒、LV-ADAM33-shRNA购自上海汉恒生物科技有限公司。ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）、重组Anti-mTOR抗体［EPR390（N）］、重组Anti-mTOR（phospho S2448）抗体［EPR426（2）］、重组Anti-TIE2抗体［EPR21915］、Anti-AKT3 （phospho S472） + AKT2 （phospho S474） + AKT1 （phospho S473）抗体［EPR18853］等购自英国Abcam公司。Tris、SDS、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Glycine、glycerine、Tween 20购自上海Sangon Biotech有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
从液氮中取出冻存的HASMCs、HPMECs原代细胞，将解冻后的细胞接种到培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞传代3-6代用于后续实验。
1.2.2 慢病毒转染基因沉默
选用干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO设计和合成均由上海吉凯基因科技有限公司完成。转染最佳MOI为1×107 TU/mL，P助感染液，感染时间72h。在2×105/mL悬浮的HASMCs中加入polybrene至6 μg/mL和适量病毒，充分混匀。37℃孵育，或者150 g室温离心4 h。于离心结束后加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene，继续培养72 h。收集细胞，评价转染效果。
1.2.3 细胞共培养与实验分组
取对数生长期的HASMCs及HPMECs，消化后移入1.5 mL灭菌离心管中，离心去除细胞碎片，调整细胞浓度为5×105个/mL；将HPMECs接种至Transwell小室的上室，100 μL/孔，HASMCs接种在Transwell小室的下室，500 μL/孔，培养24h细胞贴壁后按不同实验分组进行干预。分组如下：内皮细胞空白组（HPMECs正常培养72 h）、共培养组（HPMECs+HASMCs共培养72 h）、共培养+shRNA阴性对照组（转染阴性对照病毒并共培养72 h）、共培养+ADAM33-shRNA组（转染ADAM33-shRNA病毒并共培养72 h）。
1.2.4 CCK8细胞增殖实验
按1.2.3细胞分组及干预方法进行干预，每组5个重复。干预完成后，取出Transwell小室，弃去下室培养基，每孔加入200μL配置好的10% CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育1h，将上清液转移至96孔板中，用酶标仪测定450 nm处的OD值。
1.2.5 Transwell管腔形成实验
取50 μL/孔Matrigel基质胶加入预冷的48孔板中，置于细胞培养箱中60 min进行凝固。收集干预后的HPMECs，消化并调整为细胞浓度1×105cells/mL的单细胞悬液。在凝固后的Matrigel基质胶中每孔加入200 μL细胞悬液，标记后常规培养24 h，用显微镜观察并拍照，并用Image j软件计算血管长度。
1.2.6 ELISA
取出样本试剂，设立样本标准曲线，进行加样、孵育、洗涤、显色、中止、酶标仪检测，通过酶标物显色的深浅间接定量检测细胞共培养体系中不同处理组sADAM33、VEGFA、VEGFR2和ang-1、ang-2的表达。
1.2.7 Western
Blotting
收集不同干预组细胞，加入100 μLRIPA裂解液提取总蛋白。使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid method，BCA）测定蛋白浓度，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白质。分离蛋白后，用250mA电流将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，使用含5%脱脂奶粉的封闭液。封闭转印膜1 h后TBST漂洗。用TBST稀释一抗Tie2、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，在4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后加入稀释二抗，室温孵育2 h，再次TBST漂洗。膜上加入显影液，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。
1.3 统计学分析
所有数据采用均值±标准差（x±s）表示，运用SPSS19.0软件进行统计学分析，符合正态性、方差齐的多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用两独立样本的t检验；若不符合正态性，对数据进行对数转化，使其正态化再行比较；若方差不齐时，采用Tamhane方法进行多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖实验
各处理组间OD值的比较具有明显差异（P<0.05）；内皮细胞空白组的OD值明显低于共培养组、共培养+shRNA阴性对照组和共培养+ADAM33shRNA组，差异具有统计学意义（P<0.05）；共培养+ADAM33shRNA组OD值低于共培养组和共培养+shRNA阴性对照组（P<0.05）。见图1、表1。
图1
细胞增殖实验光学显微镜图（×100）
注：a. 内皮细胞空白组；b. 共培养组；c. 共培养+shRNA阴性对照组；d. 共培养+ADAM33-shRNA组
表1
各处理组OD值比较（x±s，n=5）
2.2 管腔形成实验
各处理组之间平均成管长度比较具有明显统计学差异（P<0.05）。共培养组、共培养+shRNA阴性对照组之间成管长度未见统计学差异（P>0.05），但平均成管长度显著高于内皮细胞空白组和共培养+ADAM33-shRNA组（P<0.05）；与内皮细胞空白组相比，共培养+ADAM33-shRNA组的成管长度明显增加（P<0.05）。见图2、表2。
图2
Transwell管腔形成实验显微镜图（×100）
注：a. 内皮细胞空白组；b. 共培养组；c. 共培养+shRNA阴性对照组；d. 共培养+ADAM33-shRNA组
表2
各处理组成管长度比较（x±s，n=5）
2.3 sADAM33和促血管生成因子的表达
内皮细胞空白组中sADAM33含量明显低于其他三组（P<0.05）；共培养+ADAM33-shRNA组中sADAM33含量低于共培养组和共培养+shRNA阴性对照组（P<0.05）。各处理组细胞共培养上清液中VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表达水平具有明显统计学差异（P<0.05）；与内皮细胞空白组相比，共培养组、共培养+shRNA阴性对照组、共培养+ADAM33-shRNA组的VEGFR2、ang-2表达水平明显增高（P<0.05）；共培养+ADAM33-shRNA组VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表达显著低于共培养组和共培养+ADAM33-shRNA组。见表3。
表3
共培养体系中sADAM33、VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表达水平
2.4 Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路变化
各处理组Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均具有统计学差异（P<0.05）；Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达在内皮细胞空白组较其余三组组显著降低（P<0.05）；在共培养+ADAM33-shRNA组较共培养组、共培养+shRNA阴性对照组减低（P<0.05）；而Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达在共培养组、共培养+shRNA阴性对照组之间未显示出统计学差异（P>0.05）。见图3、表4.
图3
Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路靶蛋白表达WB条带图
表4
Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路靶蛋白表达量的比较
3 讨论
哮喘发病机制复杂，涉及气道炎症、遗传免疫、环境暴露、呼吸道病毒感染、气道神经调节及神经信号转导等[11]。现有研究表明基因在哮喘的发病过程中发挥了重要作用，认为哮喘是一种多基因遗传病，与个体变应性体质和环境因素有关，具有明显的遗传倾向和家族聚集性[12]。气道炎症反应、气道高反应性及气道重塑为其三大特征，其中气道血管的再生与重塑又是气道重塑的主要特征[13]。
ADAM33是第一个通过定位克隆发现的哮喘易感基因，与哮喘疾病特征性的气道高反应、气道炎症和组织重构显著相关[3,14]。国内外诸多研究报道指出ADAM33基因的表达变化可能是哮喘气道重塑、气道高反应相关的效应细胞功能失调的始动因素[15]。研究显示支气管哮喘患者肺功能下降及气道高反应性与ADAM33蛋白水解酶活性提升相关，ADAM33蛋白水解酶参与气道重塑和不可逆性狭窄等病理过程[16]。课题组此前研究表明ADAM33在哮喘患者气道VSMCs中组成性表达，ADAM33基因沉默可经调控PI3K/Akt信号通路影响VSMCs的增殖和凋亡[17]，进而参与气道血管重塑。sADAM33是ADAM33的一种可溶形式，在哮喘患者气道平滑肌和基底膜组织中均呈现异常高表达，与哮喘病情的加重、肺功能的降低及气道超敏反应、炎症和重塑程度有关[18-19]。研究者发现sADAM33蛋白对血管内皮细胞的分化具有效促作用，能够加速新生血管的产生[10]。与既往文献结果一致，本研究检测到VECs中ADAM33 mRNA表达含量低，而与VECs在结构上相邻的间充质细胞（主要是VSMCs）中 ADAM33 mRNA高表达[20-21]，因此设想VSMCs膜上释放的含有金属酶催化结构域的sADAM33可能会影响内皮细胞的生物学行为。由于从哮喘患者的气道血管中分离提取血管平滑肌细胞、血管内皮细胞所需组织标本量大，本实验选择以原代细胞株作为研究对象。在单纯内皮细胞培养组检测到sADAM33含量很低，共培养体系中sADAM33主要是从HASMCs的细胞膜释放而来，其表达含量随着沉默HASMCs的ADAM33基因而减低。CCK8细胞增殖和Transwell管腔形成实验显示共培养组HPMECs的增殖能力和管腔形成较内皮细胞培养组显著增强，但若沉默共培养体系中HASMCs的ADAM33基因表达，HPMECs则呈现出细胞增殖和管腔形成能力明显下降。以上结果证明了VSMCs产生释放的sADAM33能够调控与其位置毗邻的VECs增殖和管腔形成能力，参与哮喘气道血管再生和血管重塑。
血管内皮生长因子（VEGF）是参与调控血管内皮细胞生长增殖最为重要因子之一[22]，VEGF作用的发挥有赖于其与血管内皮细胞特异性受体结合，进而激活体内信号传导发挥其生物学效应[18]。VEGFR2作为重要的血管生长因子受体，可被VEGF121-VEGF165融合体靶向调控，进而激活下游PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制血管新生与重塑。相关文献报道，VEGFR2调控血管新生与重塑功能发挥与调控VEGF、IKKs/IκBα/NF-κB、Src/FAK/ERK1/2、AKT通路等多条信号途径有关[22-25]。研究发现血管生成素ang-1和ang-2能够促进毛细血管直径快速增加，增强内皮细胞的增殖和迁移，重塑基板和刺激新血管的生成[26]。Tie2是一种重要的内皮特异性受体酪氨酸激酶，Tie2及其配体有助于血管发生和再生[27]。Tie2下游的PI3K/Akt/mTOR信号通路参与调控增殖、粘附、迁移、侵袭、代谢、生存等细胞原始行为反应，这一过程同时也调控新生血管萌芽期间内皮细胞的功能，在血管新生及重塑等疾病中发挥关键作用[28]。且有文献提到非Th2细胞因子（VEGF、SDF-1和CXCR4）水平升高，可激活AMPK导致血管生成相关因子显著降低，包括VEGF和MMP-9，从而减轻哮喘患者的新生血管的形成[29]。通过细胞共培养实验，我们发现沉默气道VSMCs的ADAM33基因表达能够减少sADAM33的释放，同时检测到共培养体系中促血管生成因子VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表达降低，并且Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路活性受抑，说明sADAM33异常表达能够影响VECs增殖和管腔形成，除VEGF/VEGFR2为重要的机制外，Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路也参与在内，其中由于VEGF的存在，ang-2与ang-1能够协同起效，一同参与气道血管重塑。
综上所述，细胞共培养实验应证了气道VSMCs和VECs之间的信息传递和交互作用，虽然ADAM33在VECs表达量极低，但来自于VSMCs释放的sADAM33可经由Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路调控VECs的增殖和管腔形成，从而参与哮喘气道血管重塑。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
支气管哮喘（简称哮喘）的病因和发病机制复杂，气道炎症反应、气道高反应性及气道重塑为其三大特征。气道重塑是指包括细支气管在内的一系列气道形态学改变，涵盖了上皮、基底膜、平滑肌和血管在内的气管壁全层[1]。研究发现无论成人还是儿童哮喘中存在气道粘膜下层和固有层微血管数量的增加，并与疾病严重程度相关[2]。由此可见，哮喘气道重塑的进程还包括气道血管的再生和重塑。去整合素金属蛋白酶33（adisintegrin and metalloproteinase，ADAM33）是ADAM家族成员之一，已被确定为哮喘易感基因[3]。研究证实ADAM33可从促进气道上皮细胞间充质转化[4]、调控成纤维细胞分化和增殖[5]、改变气道平滑肌细胞增殖能力和机械行为[6]、调节气道新生血管生成[7]等多个方面参与哮喘气道重塑。课题组先前研究结果表明轻至重度的哮喘患者都存在气道血管重塑，ADAM33的表达水平与哮喘患者气道血管重塑的严重程度密切相关；且ADAM33的异常表达能够调控气道VSMCs的表型变化，在气道血管重塑中发挥作用[8]。VECs同样是气道血管重塑和血管形成的主要效应细胞，与VSMCs在结构上相邻，在功能上交互调控。VECs的细胞膜上大量受体可探测周围环境的变化，通过一定的信号转导机制将各种刺激信号转导至细胞内[9]。VECs自身ADAM33 mRNA表达水平很低，有研究发现可溶性ADAM33（sADAM33）在体外能快速诱导内皮细胞分化，诱导新生血管形成[10]。本研究通过气道VSMCs和VECs共培养实验，探讨sADAM33的表达对VECs增殖和管腔形成的影响及可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验细胞
人肺微血管内皮细胞（Human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）、人气道平滑肌细胞 （Human airway smooth muscle cells，HASMC）来源于普诺赛生物有限公司，分别使用专用培养基培养，培养环境：37℃，5% CO2，饱和湿度。
1.1.2 试剂与抗体
阴性对照病毒、LV-ADAM33-shRNA购自上海汉恒生物科技有限公司。ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）、重组Anti-mTOR抗体［EPR390（N）］、重组Anti-mTOR（phospho S2448）抗体［EPR426（2）］、重组Anti-TIE2抗体［EPR21915］、Anti-AKT3 （phospho S472） + AKT2 （phospho S474） + AKT1 （phospho S473）抗体［EPR18853］等购自英国Abcam公司。Tris、SDS、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、Glycine、glycerine、Tween 20购自上海Sangon Biotech有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
从液氮中取出冻存的HASMCs、HPMECs原代细胞，将解冻后的细胞接种到培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。细胞传代3-6代用于后续实验。
1.2.2 慢病毒转染基因沉默
选用干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO设计和合成均由上海吉凯基因科技有限公司完成。转染最佳MOI为1×107 TU/mL，P助感染液，感染时间72h。在2×105/mL悬浮的HASMCs中加入polybrene至6 μg/mL和适量病毒，充分混匀。37℃孵育，或者150 g室温离心4 h。于离心结束后加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene，继续培养72 h。收集细胞，评价转染效果。
1.2.3 细胞共培养与实验分组
取对数生长期的HASMCs及HPMECs，消化后移入1.5 mL灭菌离心管中，离心去除细胞碎片，调整细胞浓度为5×105个/mL；将HPMECs接种至Transwell小室的上室，100 μL/孔，HASMCs接种在Transwell小室的下室，500 μL/孔，培养24h细胞贴壁后按不同实验分组进行干预。分组如下：内皮细胞空白组（HPMECs正常培养72 h）、共培养组（HPMECs+HASMCs共培养72 h）、共培养+shRNA阴性对照组（转染阴性对照病毒并共培养72 h）、共培养+ADAM33-shRNA组（转染ADAM33-shRNA病毒并共培养72 h）。
1.2.4 CCK8细胞增殖实验
按1.2.3细胞分组及干预方法进行干预，每组5个重复。干预完成后，取出Transwell小室，弃去下室培养基，每孔加入200μL配置好的10% CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育1h，将上清液转移至96孔板中，用酶标仪测定450 nm处的OD值。
1.2.5 Transwell管腔形成实验
取50 μL/孔Matrigel基质胶加入预冷的48孔板中，置于细胞培养箱中60 min进行凝固。收集干预后的HPMECs，消化并调整为细胞浓度1×105cells/mL的单细胞悬液。在凝固后的Matrigel基质胶中每孔加入200 μL细胞悬液，标记后常规培养24 h，用显微镜观察并拍照，并用Image j软件计算血管长度。
1.2.6 ELISA
取出样本试剂，设立样本标准曲线，进行加样、孵育、洗涤、显色、中止、酶标仪检测，通过酶标物显色的深浅间接定量检测细胞共培养体系中不同处理组sADAM33、VEGFA、VEGFR2和ang-1、ang-2的表达。
1.2.7 Western
Blotting
收集不同干预组细胞，加入100 μLRIPA裂解液提取总蛋白。使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid method，BCA）测定蛋白浓度，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳观察蛋白质。分离蛋白后，用250mA电流将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，使用含5%脱脂奶粉的封闭液。封闭转印膜1 h后TBST漂洗。用TBST稀释一抗Tie2、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，在4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后加入稀释二抗，室温孵育2 h，再次TBST漂洗。膜上加入显影液，用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照。
1.3 统计学分析
所有数据采用均值±标准差（x±s）表示，运用SPSS19.0软件进行统计学分析，符合正态性、方差齐的多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用两独立样本的t检验；若不符合正态性，对数据进行对数转化，使其正态化再行比较；若方差不齐时，采用Tamhane方法进行多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖实验
各处理组间OD值的比较具有明显差异（P<0.05）；内皮细胞空白组的OD值明显低于共培养组、共培养+shRNA阴性对照组和共培养+ADAM33shRNA组，差异具有统计学意义（P<0.05）；共培养+ADAM33shRNA组OD值低于共培养组和共培养+shRNA阴性对照组（P<0.05）。见图1、表1。
图1
细胞增殖实验光学显微镜图（×100）
注：a. 内皮细胞空白组；b. 共培养组；c. 共培养+shRNA阴性对照组；d. 共培养+ADAM33-shRNA组
表1
各处理组OD值比较（x±s，n=5）
2.2 管腔形成实验
各处理组之间平均成管长度比较具有明显统计学差异（P<0.05）。共培养组、共培养+shRNA阴性对照组之间成管长度未见统计学差异（P>0.05），但平均成管长度显著高于内皮细胞空白组和共培养+ADAM33-shRNA组（P<0.05）；与内皮细胞空白组相比，共培养+ADAM33-shRNA组的成管长度明显增加（P<0.05）。见图2、表2。
图2
Transwell管腔形成实验显微镜图（×100）
注：a. 内皮细胞空白组；b. 共培养组；c. 共培养+shRNA阴性对照组；d. 共培养+ADAM33-shRNA组
表2
各处理组成管长度比较（x±s，n=5）
2.3 sADAM33和促血管生成因子的表达
内皮细胞空白组中sADAM33含量明显低于其他三组（P<0.05）；共培养+ADAM33-shRNA组中sADAM33含量低于共培养组和共培养+shRNA阴性对照组（P<0.05）。各处理组细胞共培养上清液中VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表达水平具有明显统计学差异（P<0.05）；与内皮细胞空白组相比，共培养组、共培养+shRNA阴性对照组、共培养+ADAM33-shRNA组的VEGFR2、ang-2表达水平明显增高（P<0.05）；共培养+ADAM33-shRNA组VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表达显著低于共培养组和共培养+ADAM33-shRNA组。见表3。
表3
共培养体系中sADAM33、VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表达水平
2.4 Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路变化
各处理组Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平均具有统计学差异（P<0.05）；Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达在内皮细胞空白组较其余三组组显著降低（P<0.05）；在共培养+ADAM33-shRNA组较共培养组、共培养+shRNA阴性对照组减低（P<0.05）；而Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达在共培养组、共培养+shRNA阴性对照组之间未显示出统计学差异（P>0.05）。见图3、表4.
图3
Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路靶蛋白表达WB条带图
表4
Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路靶蛋白表达量的比较
3 讨论
哮喘发病机制复杂，涉及气道炎症、遗传免疫、环境暴露、呼吸道病毒感染、气道神经调节及神经信号转导等[11]。现有研究表明基因在哮喘的发病过程中发挥了重要作用，认为哮喘是一种多基因遗传病，与个体变应性体质和环境因素有关，具有明显的遗传倾向和家族聚集性[12]。气道炎症反应、气道高反应性及气道重塑为其三大特征，其中气道血管的再生与重塑又是气道重塑的主要特征[13]。
ADAM33是第一个通过定位克隆发现的哮喘易感基因，与哮喘疾病特征性的气道高反应、气道炎症和组织重构显著相关[3,14]。国内外诸多研究报道指出ADAM33基因的表达变化可能是哮喘气道重塑、气道高反应相关的效应细胞功能失调的始动因素[15]。研究显示支气管哮喘患者肺功能下降及气道高反应性与ADAM33蛋白水解酶活性提升相关，ADAM33蛋白水解酶参与气道重塑和不可逆性狭窄等病理过程[16]。课题组此前研究表明ADAM33在哮喘患者气道VSMCs中组成性表达，ADAM33基因沉默可经调控PI3K/Akt信号通路影响VSMCs的增殖和凋亡[17]，进而参与气道血管重塑。sADAM33是ADAM33的一种可溶形式，在哮喘患者气道平滑肌和基底膜组织中均呈现异常高表达，与哮喘病情的加重、肺功能的降低及气道超敏反应、炎症和重塑程度有关[18-19]。研究者发现sADAM33蛋白对血管内皮细胞的分化具有效促作用，能够加速新生血管的产生[10]。与既往文献结果一致，本研究检测到VECs中ADAM33 mRNA表达含量低，而与VECs在结构上相邻的间充质细胞（主要是VSMCs）中 ADAM33 mRNA高表达[20-21]，因此设想VSMCs膜上释放的含有金属酶催化结构域的sADAM33可能会影响内皮细胞的生物学行为。由于从哮喘患者的气道血管中分离提取血管平滑肌细胞、血管内皮细胞所需组织标本量大，本实验选择以原代细胞株作为研究对象。在单纯内皮细胞培养组检测到sADAM33含量很低，共培养体系中sADAM33主要是从HASMCs的细胞膜释放而来，其表达含量随着沉默HASMCs的ADAM33基因而减低。CCK8细胞增殖和Transwell管腔形成实验显示共培养组HPMECs的增殖能力和管腔形成较内皮细胞培养组显著增强，但若沉默共培养体系中HASMCs的ADAM33基因表达，HPMECs则呈现出细胞增殖和管腔形成能力明显下降。以上结果证明了VSMCs产生释放的sADAM33能够调控与其位置毗邻的VECs增殖和管腔形成能力，参与哮喘气道血管再生和血管重塑。
血管内皮生长因子（VEGF）是参与调控血管内皮细胞生长增殖最为重要因子之一[22]，VEGF作用的发挥有赖于其与血管内皮细胞特异性受体结合，进而激活体内信号传导发挥其生物学效应[18]。VEGFR2作为重要的血管生长因子受体，可被VEGF121-VEGF165融合体靶向调控，进而激活下游PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制血管新生与重塑。相关文献报道，VEGFR2调控血管新生与重塑功能发挥与调控VEGF、IKKs/IκBα/NF-κB、Src/FAK/ERK1/2、AKT通路等多条信号途径有关[22-25]。研究发现血管生成素ang-1和ang-2能够促进毛细血管直径快速增加，增强内皮细胞的增殖和迁移，重塑基板和刺激新血管的生成[26]。Tie2是一种重要的内皮特异性受体酪氨酸激酶，Tie2及其配体有助于血管发生和再生[27]。Tie2下游的PI3K/Akt/mTOR信号通路参与调控增殖、粘附、迁移、侵袭、代谢、生存等细胞原始行为反应，这一过程同时也调控新生血管萌芽期间内皮细胞的功能，在血管新生及重塑等疾病中发挥关键作用[28]。且有文献提到非Th2细胞因子（VEGF、SDF-1和CXCR4）水平升高，可激活AMPK导致血管生成相关因子显著降低，包括VEGF和MMP-9，从而减轻哮喘患者的新生血管的形成[29]。通过细胞共培养实验，我们发现沉默气道VSMCs的ADAM33基因表达能够减少sADAM33的释放，同时检测到共培养体系中促血管生成因子VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表达降低，并且Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路活性受抑，说明sADAM33异常表达能够影响VECs增殖和管腔形成，除VEGF/VEGFR2为重要的机制外，Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路也参与在内，其中由于VEGF的存在，ang-2与ang-1能够协同起效，一同参与气道血管重塑。
综上所述，细胞共培养实验应证了气道VSMCs和VECs之间的信息传递和交互作用，虽然ADAM33在VECs表达量极低，但来自于VSMCs释放的sADAM33可经由Tie2/PI3K/Akt/mTOR信号通路调控VECs的增殖和管腔形成，从而参与哮喘气道血管重塑。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
