引用本文： 乐奇, 吕坤, 姜雷, 王军, 姚南. 基于生物信息学分析肥大细胞表达膜蛋白1在胃癌中的表达及其与免疫浸润的关系. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(5): 599-606. doi: 10.7507/1007-9424.202107063 复制
胃癌（gastric cancer）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。根据统计，2018年胃癌新增人数达100万，死亡人数近80万（死亡率达8.2%），亚洲地区发病占主要地位[1-2]。胃癌是一种分子和表型高度异质的疾病，早期症状不明显且缺少可靠的生物标志物，约70%的胃癌患者进展至晚期阶段、部分患者发生远隔器官转移，是胃癌预后不良的因素之一[3-4]。目前免疫疗法是治疗晚期肿瘤的重要替代方案，可有效延长部分患者的生存期。目前批准使用的免疫抑制剂，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡受体1（PD-1）、程序性死亡-配体1（PD-L1）等，在恶性黑色素瘤及肾细胞癌中临床疗效显著，但对晚期胃癌的临床治疗效果不佳[5-6]。这些分子参与调节肿瘤的免疫应答，在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中它们经常表达失调，从而抑制效应T细胞对肿瘤细胞的有效杀伤[7]。免疫治疗的疗效与肿瘤免疫微环境密切相关，肿瘤免疫微环境主要包括血管、免疫细胞、基质细胞、细胞外基质等成分。复杂的微环境可通过调节增殖、化学治疗耐药性和免疫逃逸来提高肿瘤细胞的侵袭性，这对早期诊断及临床预后有重要意义[8-9]。因此，深入了解胃癌的发病机制及免疫相关机制，寻求更敏感的生物标志物至关重要。本研究通过癌症基因组图谱（the cancer genomeatlas，TCGA）数据库下载胃癌相关表达数据，筛选出与胃癌预后相关的关键基因肥大细胞表达膜蛋白 1（mast cell expressed membrane protein 1，MCEMP1），再通过CIBERSORT算法及TISIDB数据库分析其与胃癌免疫浸润的关系。
1 资料与方法
1.1 TCGA数据集分析
从TCGA在线数据库（
1.2 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建和Cox比例风险回归分析
利用蛋白质-蛋白质相互作用在线数据库（
1.3 关键基因的表达与临床病理特征及预后的相关性分析
基于TCGA获取的胃癌相关转录组FPKM数据和临床数据信息，使用R 4.0.5软件中的“limma”“ggpubr”“beeswarm”包及Wilcoxon秩和检验分析关键基因MCEMP1在胃癌组织样本及癌旁组织样本中的表达差异；利用R 4.0.5软件“survival”包分析两组之间总体生存（overall survival，OS）率的差异。并通过GEPIA（
1.4 基因集富集分析
以MSigDB的C7.all.v.7.4symbols.gmt作为目标集，使用从Broad Institute下载的基因集富集分析（GSEA）软件（版本4.1.0）对所有肿瘤病例进行GSEA分析，得出差异具有统计学意义的基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路。采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设为1 000次，其他参数设为默认值。仅将名义（NOM）P<0.05的基因集视为显著富集的基因集，具有统计学意义。
1.5 肿瘤免疫细胞浸润分析
CIBERSORT是一种基于基因表达的反卷积算法，用于量化肿瘤浸润的免疫细胞的比例，为了提高反卷积算法的准确性，对每个样本文件计算了CIBERSORT P值，仅将CIBERSORT P值<0.05的数据进行过滤并选择用于下一步分析。使用R 4.0.5软件中的“limma”“vioplot”“ggplot2”“ggpubr”和“ggExtra”包，对胃癌中的免疫细胞进行定量差异分析，并使用Spearman秩相关分析MCEMP1表达与浸润免疫细胞之间的相关性。本部分研究基于1.1中的TCGA数据。
1.6 TISIDB数据库分析
TISIDB在线数据库（
1.7 统计学方法
本研究数据分析采用R 4.0.5、Strawberry Perl 5.32.1、GSEA 4.1.0软件进行。采用Wilcoxon秩和检验分析关键基因在胃癌中的差异表达情况，采用Kruskal-Wallis秩和检验分析关键基因与胃癌临床病理特征之间的相关性，采用Spearman秩相关分析MCEMP1表达与浸润免疫细胞及免疫分子之间的相关性。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 筛选胃癌关键基因
2.1.1 筛选胃癌组织及其癌旁组织中的DEGs
以︱log2FC︱>1、FDR<0.05为标准，筛选基质组（低分和高分）和免疫组（低分和高分）中的DEGs。在基质评分队列中筛选出1 756种DEGs，其中1 535种基因表达上调，221种基因表达下调；在免疫评分队列中筛选出1 169种DEGs，其中881种基因表达上调，288种基因表达下调。本研究选取基质组和免疫组（低分和高分）中前20种差异明显的DEGs（表1），并对基质和免疫评分队列中共表达上调（640种）及下调（120种）的DEGs进行韦恩图可视化（图1a和1b）。
表1
基质评分组与免疫评分组（低分和高分）中的前 20 种 DEGs
图1
示胃癌中差异表达的基因、MCEMP1的表达及其与预后的关系
a、b：基质评分和免疫评分中表达上调（a）及下调（b）DEGs的韦恩图；c：单因素Cox比例风险回归分析所示的前11种差异表达基因，以
2.1.2 筛选关键基因
以交互关系大于0.900并隐藏网络中已断开的节点为标准，在STRING在线数据库中对760种DEGs进行网络构建，最终该网络覆盖了247个节点和1 735个边。利用单因素Cox比例风险回归分析研究这些DEGs与胃癌预后的相关性，并筛选出具有统计学意义的DGEs共26种，本研究按P<0.01进一步筛选出11种DGEs，并绘制森林图（图1c）。将PPI网络中交互节点数在前60位的DGEs和单因素Cox比例风险回归分析结果筛选出的DEGs进行交叉分析发现，MCEMP1是这两个分析中唯一的重叠基因（图1d）。
2.2 MCEMP1与胃癌预后相关
在本研究中，笔者通过计算MCEMP1表达量的中位值将所有胃癌病例分为高和低MCEMP1表达组，Wilcoxon秩和检验结果表明：MCEMP1在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.001），见图1e。生存分析结果表明，胃癌患者中MCEMP1的高表达与预后呈负相关［HR=1.176，95%CI（1.066，1.297），P=0.046］，见图1f。进一步使用GEPIA数据库验证MCEMP1表达与胃癌患者预后的相关性，其结果也显示MCEMP1高表达组的OS差于低表达组（P=0.012），见图1g。
基于Kruskal-Wallis秩和检验统计分析，结果显示MCEMP1表达水平分别与年龄、胃癌T分期及临床分期存在相关性（P<0.05），而与性别、组织学分级、胃癌N分期及M分期无明显关联（P>0.05），见图2a～2g。结合上述结果，本研究发现MCEMP1过表达可能与胃癌的进展有关，可能是胃癌预后的相关生物标志物。
图2
示MCEMP1表达与临床病理特征之间的相关性、胃癌中MCEMP1的GSEA分析及免疫细胞浸润水平比较，以及MCEMP1表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性
a～g：MCEMP1表达与临床病理特征之间的相关性，包括年龄（a）、性别（b）、T分期（c）、N分期（d）、M分期（e）、临床分期（f）、组织学分级（g）；h：MCEMP1功能富集分析；i：MCEMP1高表达组和低表达组中22种免疫细胞浸润水平比较，绿色代表MCEMP1低表达组，红色代表MCEMP1高表达组；j～u：MCEMP1表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性，包括中性粒细胞（j）、嗜酸性粒细胞（k）、巨噬细胞M0（l）、巨噬细胞M2（m）、静息NK细胞（n）、活化肥大细胞（o）、CD8+T细胞（p）、Tregs（q）、活化NK细胞（r）、静息CD4记忆T细胞（s）、幼稚B细胞（t）、静息肥大细胞（u）
2.3 GSEA富集分析
为了探索MCEMP1在胃癌中的生物学功能及作用途径，利用GSEA中MSigDB收集的C7基因集来分析MCEMP1高表达组及低表达组中差异具有统计学意义的通路，本研究进一步筛选与免疫相关的信号通路（图2h）。其结果显示，MCEMP1高表达样本主要富集在核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体信号通路、蛋白酶体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、TOLL样受体（Toll-like reporters，TLRs）信号通路、胞质DNA传感途径、移植物抗宿主病、视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ（RIG-Ⅰ）样受体信号通路及NK细胞介导的细胞毒性途径。
2.4 MCEMP1与免疫浸润细胞相关
基于CIBERSORT算法分析肿瘤浸润的免疫细胞的比例，根据MCEMP1表达的中位值，将 375 个肿瘤样本分为高低表达两组，评估肿瘤样本中 22 种免疫细胞比例（图2i），筛选出了12种差异有统计学意义的免疫细胞。相关性分析结果显示：MCEMP1的表达水平与巨噬细胞M0和M2、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、静息NK细胞、活性肥大细胞比例呈正相关（P<0.05），与幼稚B细胞、静息CD4记忆T细胞、静息肥大细胞、CD8+T细胞、活性NK细胞和调节性T细胞（Tregs）比例呈负相关（P<0.05），见图2j－2u。
2.5 MCEMP1与免疫分子有关
为了进一步探索MCMEP1与胃癌免疫浸润的关系，本研究从TISIDB数据库下载了MCEMP1表达与免疫调节剂、趋化因子及其受体之间的相关数据。相关性分析结果显示，MCEMP1与免疫抑制因子 ［包括细胞程序性死亡蛋白1配体2（PDCD1LG2，rs=0.327）、甲型肝炎病毒细胞受体2（HAVCR2，rs=0.379）、分化簇（CD）274（rs=0.340）、白细胞介素（IL）-10（rs=0.324）、集落刺激因子1受体（CSF1R，rs=0.284）和IL-10RB（rs=0.246）］、免疫刺激因子 ［CD86（rs=0.387）、IL-6（rs=0.394）、CD80（rs=0.383）、IL-2RA（rs=0.375）、CD276（rs=0.324）和肿瘤坏死因子受体超家族成员4（TNFSF4，rs=0.250）］、趋化因子 ［C-X-C 基序趋化因子配体（CXCL）8（rs=0.612）、CXCL1（rs=0.546）、C-C 基序趋化因子配体（CCL）3（rs=0.506）、CCL7（rs=0.559）、CCL8（rs=0.439）和CCL18（rs=0.464）］和趋化因子受体 ［C-X-C 基序趋化因子受体（CXCR）1（rs=0.680）、CXCR2（rs=0.615）、C-C 基序趋化因子受体（CCR）1（rs=0.423）、CCR2（rs=0.216）、CCR3（rs=0.429）和CCR8（rs=0.187）］之间均存在正相关关系（P<0.05），见图3。
图3
示MCEMP1 表达水平与免疫分子之间的相关性散点图
a～f：免疫抑制因子，包括PDCD1LG2（a）、HAVCR2（b）、CD274（c）、IL-10（d）、CSF1R（e）、IL-10RB（f）；g～l：免疫刺激因子，包括CD80（g）、CD86（h）、CD276（i）、IL-2RA（j）、TNFSF4（k）、IL-6（l）；m～r：趋化因子，包括CCL3（m）、CCL7（n）、CCL8（o）、CCL18（p）、CXCL1（q）、CXCL8（r）；s～x：趋化因子受体，包括CCR1（s）、CCR2（t）、CCR3（u）、CCR8（v）、CXCR1（w）、CXCR2（x）
3 讨论
大量证据表明，TME在肿瘤发生、发展及临床治疗疗效中起着至关重要的作用，肿瘤细胞可以通过分泌各种细胞因子、趋化因子和其他因子来重塑微环境[10-12]。另外，已经进行了一些研究来剖析胃癌中TME的特征[13-14]。探索TME中各类细胞的潜在机制可能是一种有前景的策略，可能为胃癌的治疗提供新的选择[15]。本研究基于胃癌样本的转录组学数据分析免疫和基质细胞的组分，然后提取DGEs，利用DEGs蛋白质互作网络分析及单因素Cox比例风险回归分析筛选出关键基因MCEMP1。MCEMP1（也被称为CR19ORF59）是肥大细胞表达的一种跨膜蛋白，其C末端暴露于细胞膜外，而N末端分布在细胞质。肥大细胞表面的跨膜蛋白与周围组织中的细胞接触，从而介导其周围环境的信号调节[16]。目前研究认为，MCEMP1参与调节肥大细胞分化及相关免疫反应机制[16-17]。肥大细胞在调节急性和慢性炎症反应、微环境的重建等过程发挥重要作用[18]，而慢性炎症又是癌症发生的重要原因[19-20]。肿瘤中浸润的肥大细胞有利于肿瘤细胞的增殖和侵袭，也可以间接通过重塑TME和调节肿瘤细胞的免疫应答来加速肿瘤的进展[21]。肥大细胞通过释放经典的促血管生成因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、血小板衍生生长因子（PDGF）和白介素6（IL-6），以及非经典的促血管生成因子（主要是蛋白酶，包括类胰蛋白酶和糜酶），从而积极地促进血管生成并诱导新血管形成[22-23]。这些均提示MCEMP1可能与肿瘤的发生、进展及肿瘤免疫密切相关。
正如大量资料报道，免疫细胞可以诱导胃癌免疫微环境的重塑，进而影响胃癌患者的预后[24-26]。基于CIBERSORT算法、差异分析及相关性分析的结果表明，MCEMP1与肿瘤免疫细胞浸润有关，其中巨噬细胞M0/M2、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、静息NK细胞及活性肥大细胞与MCEMP1的表达水平呈正相关，而幼稚B细胞、静息CD4记忆T细胞、CD8+T细胞、静息肥大细胞、活性NK细胞及Tregs与MCEMP1的表达水平呈负相关。研究[27]指出，在胃癌中IL33可以激活肥大细胞及肿瘤相关巨噬细胞（TAM），从而发挥促肿瘤作用。另外，肥大细胞在胃癌微环境中蓄积，并参与肿瘤新生血管形成，促进肿瘤生长和转移[28]。TAM的常见表型M2巨噬细胞可以分泌多种细胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、VEGF等，发挥促肿瘤作用。胃癌患者的肿瘤区域内的肥大细胞及M2巨噬细胞的密度均增加[28-29]。这可能揭示MCEMP1的高表达有助于肥大细胞及M2巨噬细胞的免疫反应及浸润，共同说明MCEMP1可以作用于胃癌浸润免疫细胞的调节和募集。
NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，参与早期防御及肿瘤免疫监视，通过与肿瘤细胞相互作用直接发挥抗肿瘤作用，也可以通过影响TME中其他免疫细胞的活性间接杀伤癌细胞[30]，这与本研究的结果一致。肿瘤中浸润的Treg可以抑制肿瘤相关的树突状细胞的免疫活性，在免疫逃逸中起关键作用，以促进胃癌的免疫耐受性[31]。而本研究发现MCEMP1的表达水平与Treg的浸润水平呈负相关。研究报道Treg的募集随着肿瘤进展而降低，说明TME中的Treg是动态分布的[32]。消化系统中Th17细胞和Treg之间的平衡保障了免疫系统的稳态和正常功能，但TME可能会扰乱二者之间的平衡[31]。Th17细胞可以驱动抗肿瘤免疫反应[33-34]，因此笔者推测在胃癌的发展中MCEMP1的表达可能与Treg之间的相关性会减弱，与Th17细胞的相关性增强。通过进一步分析TISIDB数据，证实MCEMP1与胃癌中的多种免疫分子有关，可能影响TME中的免疫浸润。这些均揭示MCEMP1与胃癌免疫浸润密切相关，它可能通过这些免疫细胞及免疫分子参与调节胃癌的发生发展。
为了进一步了解MCEMP1在胃癌中的调控机制，本研究基于GSEA数据库进行KEGG基因富集分析，结果表明，MCEMP1涉及的通路包括NOD样受体信号通路、蛋白酶体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、TLRs信号通路、胞质DNA传感途径、移植物抗宿主病、RIG-Ⅰ样受体信号通路及NK细胞介导的细胞毒性途径。TLRs信号通路参与调节广泛的生物反应，包括肿瘤的炎症和免疫反应；在多种肿瘤细胞中表达，在不同的肿瘤中可表现出不同的生物学功能，如TLR5在乳腺癌和胃癌中均高表达，TLR5信号传导促进胃癌增殖[35]，但却抑制乳腺癌的生长[36]。TLRs可能通过TME或肿瘤细胞本身的促炎反应、抗细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖和促纤维化信号发挥致癌作用[37]。TLRs是炎症信号传导的重要调节因子，其异常激活致使NF-κB信号激活和炎症细胞因子的过度表达[38]（如IL-1β、TNF-α和IL-6），而这些炎症细胞因子是促进胃癌、肝癌和结直肠癌发生发展的重要因素[39]。研究[40]表明，TLRs通过刺激细胞因子IL-1β和TNF-α的释放，使靶细胞中的NF-κB信号活化。而在抗细胞凋亡途径中，NF-κB是调控抗凋亡基因表达的最关键的信号，同时也抑制了促凋亡途径。因此，TLRs诱导的NF-κB激活可以促进肿瘤细胞的存活及增殖[41]。MCEMP1的启动子区域包含NF-κB结合基序[16]，而NF-κB是TLRs信号通路重要的环节之一，共同参与TLRs信号通路发挥促肿瘤作用。以上研究结果表明，MCEMP1过表达可能通过TLRs信号通路介导的NF-κB信号激活，进一步调节体内慢性炎症、肿瘤细胞促炎反应、抗细胞凋亡等过程，参与胃癌的发生发展。
本研究基于生物信息学分析发现MCEMP1与胃癌发生、发展等过程密切相关，其高表达与胃癌总体生存、多种免疫浸润细胞及免疫分子有关，有作为胃癌潜在标志物及治疗靶点的可能。但本研究是基于生物信息学分析得出的结果，仍需进一步组织学或细胞学实验进行深入探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：乐奇是本研究设计者和执行者，同时参与数据提取分析及论文初稿的写作；吕坤参与结果讨论与分析；王军和姜雷参与实施研究、获取研究经费；姚南是本研究的监督者并参与文章润色及修改。
胃癌（gastric cancer）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。根据统计，2018年胃癌新增人数达100万，死亡人数近80万（死亡率达8.2%），亚洲地区发病占主要地位[1-2]。胃癌是一种分子和表型高度异质的疾病，早期症状不明显且缺少可靠的生物标志物，约70%的胃癌患者进展至晚期阶段、部分患者发生远隔器官转移，是胃癌预后不良的因素之一[3-4]。目前免疫疗法是治疗晚期肿瘤的重要替代方案，可有效延长部分患者的生存期。目前批准使用的免疫抑制剂，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡受体1（PD-1）、程序性死亡-配体1（PD-L1）等，在恶性黑色素瘤及肾细胞癌中临床疗效显著，但对晚期胃癌的临床治疗效果不佳[5-6]。这些分子参与调节肿瘤的免疫应答，在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中它们经常表达失调，从而抑制效应T细胞对肿瘤细胞的有效杀伤[7]。免疫治疗的疗效与肿瘤免疫微环境密切相关，肿瘤免疫微环境主要包括血管、免疫细胞、基质细胞、细胞外基质等成分。复杂的微环境可通过调节增殖、化学治疗耐药性和免疫逃逸来提高肿瘤细胞的侵袭性，这对早期诊断及临床预后有重要意义[8-9]。因此，深入了解胃癌的发病机制及免疫相关机制，寻求更敏感的生物标志物至关重要。本研究通过癌症基因组图谱（the cancer genomeatlas，TCGA）数据库下载胃癌相关表达数据，筛选出与胃癌预后相关的关键基因肥大细胞表达膜蛋白 1（mast cell expressed membrane protein 1，MCEMP1），再通过CIBERSORT算法及TISIDB数据库分析其与胃癌免疫浸润的关系。
1 资料与方法
1.1 TCGA数据集分析
从TCGA在线数据库（
1.2 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建和Cox比例风险回归分析
利用蛋白质-蛋白质相互作用在线数据库（
1.3 关键基因的表达与临床病理特征及预后的相关性分析
基于TCGA获取的胃癌相关转录组FPKM数据和临床数据信息，使用R 4.0.5软件中的“limma”“ggpubr”“beeswarm”包及Wilcoxon秩和检验分析关键基因MCEMP1在胃癌组织样本及癌旁组织样本中的表达差异；利用R 4.0.5软件“survival”包分析两组之间总体生存（overall survival，OS）率的差异。并通过GEPIA（
1.4 基因集富集分析
以MSigDB的C7.all.v.7.4symbols.gmt作为目标集，使用从Broad Institute下载的基因集富集分析（GSEA）软件（版本4.1.0）对所有肿瘤病例进行GSEA分析，得出差异具有统计学意义的基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集通路。采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设为1 000次，其他参数设为默认值。仅将名义（NOM）P<0.05的基因集视为显著富集的基因集，具有统计学意义。
1.5 肿瘤免疫细胞浸润分析
CIBERSORT是一种基于基因表达的反卷积算法，用于量化肿瘤浸润的免疫细胞的比例，为了提高反卷积算法的准确性，对每个样本文件计算了CIBERSORT P值，仅将CIBERSORT P值<0.05的数据进行过滤并选择用于下一步分析。使用R 4.0.5软件中的“limma”“vioplot”“ggplot2”“ggpubr”和“ggExtra”包，对胃癌中的免疫细胞进行定量差异分析，并使用Spearman秩相关分析MCEMP1表达与浸润免疫细胞之间的相关性。本部分研究基于1.1中的TCGA数据。
1.6 TISIDB数据库分析
TISIDB在线数据库（
1.7 统计学方法
本研究数据分析采用R 4.0.5、Strawberry Perl 5.32.1、GSEA 4.1.0软件进行。采用Wilcoxon秩和检验分析关键基因在胃癌中的差异表达情况，采用Kruskal-Wallis秩和检验分析关键基因与胃癌临床病理特征之间的相关性，采用Spearman秩相关分析MCEMP1表达与浸润免疫细胞及免疫分子之间的相关性。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 筛选胃癌关键基因
2.1.1 筛选胃癌组织及其癌旁组织中的DEGs
以︱log2FC︱>1、FDR<0.05为标准，筛选基质组（低分和高分）和免疫组（低分和高分）中的DEGs。在基质评分队列中筛选出1 756种DEGs，其中1 535种基因表达上调，221种基因表达下调；在免疫评分队列中筛选出1 169种DEGs，其中881种基因表达上调，288种基因表达下调。本研究选取基质组和免疫组（低分和高分）中前20种差异明显的DEGs（表1），并对基质和免疫评分队列中共表达上调（640种）及下调（120种）的DEGs进行韦恩图可视化（图1a和1b）。
表1
基质评分组与免疫评分组（低分和高分）中的前 20 种 DEGs
图1
示胃癌中差异表达的基因、MCEMP1的表达及其与预后的关系
a、b：基质评分和免疫评分中表达上调（a）及下调（b）DEGs的韦恩图；c：单因素Cox比例风险回归分析所示的前11种差异表达基因，以
2.1.2 筛选关键基因
以交互关系大于0.900并隐藏网络中已断开的节点为标准，在STRING在线数据库中对760种DEGs进行网络构建，最终该网络覆盖了247个节点和1 735个边。利用单因素Cox比例风险回归分析研究这些DEGs与胃癌预后的相关性，并筛选出具有统计学意义的DGEs共26种，本研究按P<0.01进一步筛选出11种DGEs，并绘制森林图（图1c）。将PPI网络中交互节点数在前60位的DGEs和单因素Cox比例风险回归分析结果筛选出的DEGs进行交叉分析发现，MCEMP1是这两个分析中唯一的重叠基因（图1d）。
2.2 MCEMP1与胃癌预后相关
在本研究中，笔者通过计算MCEMP1表达量的中位值将所有胃癌病例分为高和低MCEMP1表达组，Wilcoxon秩和检验结果表明：MCEMP1在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.001），见图1e。生存分析结果表明，胃癌患者中MCEMP1的高表达与预后呈负相关［HR=1.176，95%CI（1.066，1.297），P=0.046］，见图1f。进一步使用GEPIA数据库验证MCEMP1表达与胃癌患者预后的相关性，其结果也显示MCEMP1高表达组的OS差于低表达组（P=0.012），见图1g。
基于Kruskal-Wallis秩和检验统计分析，结果显示MCEMP1表达水平分别与年龄、胃癌T分期及临床分期存在相关性（P<0.05），而与性别、组织学分级、胃癌N分期及M分期无明显关联（P>0.05），见图2a～2g。结合上述结果，本研究发现MCEMP1过表达可能与胃癌的进展有关，可能是胃癌预后的相关生物标志物。
图2
示MCEMP1表达与临床病理特征之间的相关性、胃癌中MCEMP1的GSEA分析及免疫细胞浸润水平比较，以及MCEMP1表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性
a～g：MCEMP1表达与临床病理特征之间的相关性，包括年龄（a）、性别（b）、T分期（c）、N分期（d）、M分期（e）、临床分期（f）、组织学分级（g）；h：MCEMP1功能富集分析；i：MCEMP1高表达组和低表达组中22种免疫细胞浸润水平比较，绿色代表MCEMP1低表达组，红色代表MCEMP1高表达组；j～u：MCEMP1表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性，包括中性粒细胞（j）、嗜酸性粒细胞（k）、巨噬细胞M0（l）、巨噬细胞M2（m）、静息NK细胞（n）、活化肥大细胞（o）、CD8+T细胞（p）、Tregs（q）、活化NK细胞（r）、静息CD4记忆T细胞（s）、幼稚B细胞（t）、静息肥大细胞（u）
2.3 GSEA富集分析
为了探索MCEMP1在胃癌中的生物学功能及作用途径，利用GSEA中MSigDB收集的C7基因集来分析MCEMP1高表达组及低表达组中差异具有统计学意义的通路，本研究进一步筛选与免疫相关的信号通路（图2h）。其结果显示，MCEMP1高表达样本主要富集在核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体信号通路、蛋白酶体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、TOLL样受体（Toll-like reporters，TLRs）信号通路、胞质DNA传感途径、移植物抗宿主病、视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ（RIG-Ⅰ）样受体信号通路及NK细胞介导的细胞毒性途径。
2.4 MCEMP1与免疫浸润细胞相关
基于CIBERSORT算法分析肿瘤浸润的免疫细胞的比例，根据MCEMP1表达的中位值，将 375 个肿瘤样本分为高低表达两组，评估肿瘤样本中 22 种免疫细胞比例（图2i），筛选出了12种差异有统计学意义的免疫细胞。相关性分析结果显示：MCEMP1的表达水平与巨噬细胞M0和M2、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、静息NK细胞、活性肥大细胞比例呈正相关（P<0.05），与幼稚B细胞、静息CD4记忆T细胞、静息肥大细胞、CD8+T细胞、活性NK细胞和调节性T细胞（Tregs）比例呈负相关（P<0.05），见图2j－2u。
2.5 MCEMP1与免疫分子有关
为了进一步探索MCMEP1与胃癌免疫浸润的关系，本研究从TISIDB数据库下载了MCEMP1表达与免疫调节剂、趋化因子及其受体之间的相关数据。相关性分析结果显示，MCEMP1与免疫抑制因子 ［包括细胞程序性死亡蛋白1配体2（PDCD1LG2，rs=0.327）、甲型肝炎病毒细胞受体2（HAVCR2，rs=0.379）、分化簇（CD）274（rs=0.340）、白细胞介素（IL）-10（rs=0.324）、集落刺激因子1受体（CSF1R，rs=0.284）和IL-10RB（rs=0.246）］、免疫刺激因子 ［CD86（rs=0.387）、IL-6（rs=0.394）、CD80（rs=0.383）、IL-2RA（rs=0.375）、CD276（rs=0.324）和肿瘤坏死因子受体超家族成员4（TNFSF4，rs=0.250）］、趋化因子 ［C-X-C 基序趋化因子配体（CXCL）8（rs=0.612）、CXCL1（rs=0.546）、C-C 基序趋化因子配体（CCL）3（rs=0.506）、CCL7（rs=0.559）、CCL8（rs=0.439）和CCL18（rs=0.464）］和趋化因子受体 ［C-X-C 基序趋化因子受体（CXCR）1（rs=0.680）、CXCR2（rs=0.615）、C-C 基序趋化因子受体（CCR）1（rs=0.423）、CCR2（rs=0.216）、CCR3（rs=0.429）和CCR8（rs=0.187）］之间均存在正相关关系（P<0.05），见图3。
图3
示MCEMP1 表达水平与免疫分子之间的相关性散点图
a～f：免疫抑制因子，包括PDCD1LG2（a）、HAVCR2（b）、CD274（c）、IL-10（d）、CSF1R（e）、IL-10RB（f）；g～l：免疫刺激因子，包括CD80（g）、CD86（h）、CD276（i）、IL-2RA（j）、TNFSF4（k）、IL-6（l）；m～r：趋化因子，包括CCL3（m）、CCL7（n）、CCL8（o）、CCL18（p）、CXCL1（q）、CXCL8（r）；s～x：趋化因子受体，包括CCR1（s）、CCR2（t）、CCR3（u）、CCR8（v）、CXCR1（w）、CXCR2（x）
3 讨论
大量证据表明，TME在肿瘤发生、发展及临床治疗疗效中起着至关重要的作用，肿瘤细胞可以通过分泌各种细胞因子、趋化因子和其他因子来重塑微环境[10-12]。另外，已经进行了一些研究来剖析胃癌中TME的特征[13-14]。探索TME中各类细胞的潜在机制可能是一种有前景的策略，可能为胃癌的治疗提供新的选择[15]。本研究基于胃癌样本的转录组学数据分析免疫和基质细胞的组分，然后提取DGEs，利用DEGs蛋白质互作网络分析及单因素Cox比例风险回归分析筛选出关键基因MCEMP1。MCEMP1（也被称为CR19ORF59）是肥大细胞表达的一种跨膜蛋白，其C末端暴露于细胞膜外，而N末端分布在细胞质。肥大细胞表面的跨膜蛋白与周围组织中的细胞接触，从而介导其周围环境的信号调节[16]。目前研究认为，MCEMP1参与调节肥大细胞分化及相关免疫反应机制[16-17]。肥大细胞在调节急性和慢性炎症反应、微环境的重建等过程发挥重要作用[18]，而慢性炎症又是癌症发生的重要原因[19-20]。肿瘤中浸润的肥大细胞有利于肿瘤细胞的增殖和侵袭，也可以间接通过重塑TME和调节肿瘤细胞的免疫应答来加速肿瘤的进展[21]。肥大细胞通过释放经典的促血管生成因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、血小板衍生生长因子（PDGF）和白介素6（IL-6），以及非经典的促血管生成因子（主要是蛋白酶，包括类胰蛋白酶和糜酶），从而积极地促进血管生成并诱导新血管形成[22-23]。这些均提示MCEMP1可能与肿瘤的发生、进展及肿瘤免疫密切相关。
正如大量资料报道，免疫细胞可以诱导胃癌免疫微环境的重塑，进而影响胃癌患者的预后[24-26]。基于CIBERSORT算法、差异分析及相关性分析的结果表明，MCEMP1与肿瘤免疫细胞浸润有关，其中巨噬细胞M0/M2、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、静息NK细胞及活性肥大细胞与MCEMP1的表达水平呈正相关，而幼稚B细胞、静息CD4记忆T细胞、CD8+T细胞、静息肥大细胞、活性NK细胞及Tregs与MCEMP1的表达水平呈负相关。研究[27]指出，在胃癌中IL33可以激活肥大细胞及肿瘤相关巨噬细胞（TAM），从而发挥促肿瘤作用。另外，肥大细胞在胃癌微环境中蓄积，并参与肿瘤新生血管形成，促进肿瘤生长和转移[28]。TAM的常见表型M2巨噬细胞可以分泌多种细胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、VEGF等，发挥促肿瘤作用。胃癌患者的肿瘤区域内的肥大细胞及M2巨噬细胞的密度均增加[28-29]。这可能揭示MCEMP1的高表达有助于肥大细胞及M2巨噬细胞的免疫反应及浸润，共同说明MCEMP1可以作用于胃癌浸润免疫细胞的调节和募集。
NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，参与早期防御及肿瘤免疫监视，通过与肿瘤细胞相互作用直接发挥抗肿瘤作用，也可以通过影响TME中其他免疫细胞的活性间接杀伤癌细胞[30]，这与本研究的结果一致。肿瘤中浸润的Treg可以抑制肿瘤相关的树突状细胞的免疫活性，在免疫逃逸中起关键作用，以促进胃癌的免疫耐受性[31]。而本研究发现MCEMP1的表达水平与Treg的浸润水平呈负相关。研究报道Treg的募集随着肿瘤进展而降低，说明TME中的Treg是动态分布的[32]。消化系统中Th17细胞和Treg之间的平衡保障了免疫系统的稳态和正常功能，但TME可能会扰乱二者之间的平衡[31]。Th17细胞可以驱动抗肿瘤免疫反应[33-34]，因此笔者推测在胃癌的发展中MCEMP1的表达可能与Treg之间的相关性会减弱，与Th17细胞的相关性增强。通过进一步分析TISIDB数据，证实MCEMP1与胃癌中的多种免疫分子有关，可能影响TME中的免疫浸润。这些均揭示MCEMP1与胃癌免疫浸润密切相关，它可能通过这些免疫细胞及免疫分子参与调节胃癌的发生发展。
为了进一步了解MCEMP1在胃癌中的调控机制，本研究基于GSEA数据库进行KEGG基因富集分析，结果表明，MCEMP1涉及的通路包括NOD样受体信号通路、蛋白酶体、细胞因子与细胞因子受体相互作用、TLRs信号通路、胞质DNA传感途径、移植物抗宿主病、RIG-Ⅰ样受体信号通路及NK细胞介导的细胞毒性途径。TLRs信号通路参与调节广泛的生物反应，包括肿瘤的炎症和免疫反应；在多种肿瘤细胞中表达，在不同的肿瘤中可表现出不同的生物学功能，如TLR5在乳腺癌和胃癌中均高表达，TLR5信号传导促进胃癌增殖[35]，但却抑制乳腺癌的生长[36]。TLRs可能通过TME或肿瘤细胞本身的促炎反应、抗细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖和促纤维化信号发挥致癌作用[37]。TLRs是炎症信号传导的重要调节因子，其异常激活致使NF-κB信号激活和炎症细胞因子的过度表达[38]（如IL-1β、TNF-α和IL-6），而这些炎症细胞因子是促进胃癌、肝癌和结直肠癌发生发展的重要因素[39]。研究[40]表明，TLRs通过刺激细胞因子IL-1β和TNF-α的释放，使靶细胞中的NF-κB信号活化。而在抗细胞凋亡途径中，NF-κB是调控抗凋亡基因表达的最关键的信号，同时也抑制了促凋亡途径。因此，TLRs诱导的NF-κB激活可以促进肿瘤细胞的存活及增殖[41]。MCEMP1的启动子区域包含NF-κB结合基序[16]，而NF-κB是TLRs信号通路重要的环节之一，共同参与TLRs信号通路发挥促肿瘤作用。以上研究结果表明，MCEMP1过表达可能通过TLRs信号通路介导的NF-κB信号激活，进一步调节体内慢性炎症、肿瘤细胞促炎反应、抗细胞凋亡等过程，参与胃癌的发生发展。
本研究基于生物信息学分析发现MCEMP1与胃癌发生、发展等过程密切相关，其高表达与胃癌总体生存、多种免疫浸润细胞及免疫分子有关，有作为胃癌潜在标志物及治疗靶点的可能。但本研究是基于生物信息学分析得出的结果，仍需进一步组织学或细胞学实验进行深入探讨。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：乐奇是本研究设计者和执行者，同时参与数据提取分析及论文初稿的写作；吕坤参与结果讨论与分析；王军和姜雷参与实施研究、获取研究经费；姚南是本研究的监督者并参与文章润色及修改。
