引用本文： 刘源欣, 付来华, 刘昊天, 张耕溥, 肖婉祎, 高梓唯, 张洪亮, 杨吉龙. 恶性周围神经鞘瘤中细胞周期蛋白依赖性激酶1的表达及其临床意义. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(10): 1220-1228. doi: 10.7507/1002-1892.202406090 复制
恶性周围神经鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一种罕见且具有高度侵袭性的软组织肉瘤，起源于周围神经或其鞘膜，多见于20～50岁人群，占所有软组织肉瘤的5%～10%。该肿瘤的发病与Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）密切相关，约50% MPNST患者发生于NF1患者中。MPNST具有高度恶性特性，易复发和转移，预后较差。尽管手术切除是主要治疗手段，但由于肿瘤的侵袭性和复杂的生物学行为，临床治疗效果有限。
MPNST的相关基因组学分析研究表明，NF1双等位基因的功能性缺失和RAS基因异常激活、CDKN2A基因组位点的杂合性缺失是MPNST细胞发生中上游突变的关键环节[1]。细胞周期蛋白依赖性激酶1（cell-cycle dependent kinase 1，CDK1）作为一种参与调控细胞增殖和迁移、炎症反应、免疫应激的关键因子，已逐渐被国内外学者关注[2]。CDK1作为细胞周期的核心调控因子，其异常表达与多种癌症的发生、发展密切相关，如在乳腺癌、肺癌和胃癌中CDK1为高表达状态，且与肿瘤细胞增殖加快、侵袭性增强和患者预后较差相关[3-4]。
为了研究CDK1在MPNST中的分子生物学特性以及其临床意义，本研究对来自天津市肿瘤医院的MPNST样本和正常组织样本进行了转录组测序，并结合外部数据集进行生物信息学分析，进一步利用免疫组织化学染色分析CDK1蛋白在MPNST组织中的表达情况，为临床治疗策略提供新的方向。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2011年9月—2020年3月于天津市肿瘤医院接受手术切除治疗，并经组织学、病理学证实的56例MPNST患者肿瘤样本及17例正常组织样本（同一MPNST患者距离肿瘤边缘5 cm以上的非肿瘤组织）作为研究对象。其中男32例，女24例；年龄12～82岁，平均51岁。病变位于四肢22例，头颈部1例，躯干14例，内脏7例，其他部位10例。患者入院时39例为原发病灶，17例为复发病灶。其中NF1型患者12例（21.4%）。肿瘤为单发42例，多发14例；肿瘤最大径2.0～18.0 cm，平均7.1 cm，其中<5 cm 21例，5～10 cm 26例，>10 cm 9例。术后复发12例（21.4%），远处转移（远隔部位皮肤、软组织、器官的转移和/或非区域淋巴结转移）13例（23.2%）；接受化疗23例，放疗13例。将切除后的肿瘤和正常组织置入–196℃超低温液氮罐冻存。
1.2 转录组测序及生物信息学分析
1.2.1 转录组测序
取56例MPNST患者的冷冻组织和17例正常组织样本，采用Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取RNA，按照MGlEasy mRNA文库试剂盒（深圳华大智造科技股份有限公司）方法构建mRNA文库，在DNBSEO-G400测序仪（深圳华大智造科技股份有限公司）上对PE150循环的mRNA文库进行测序。使用子读取对齐器将读段与人类参考基因组 （GRCh38） 进行比对，在计算机R studio软件中利用edgeR R包对RNA读取计数进行归一化，将每个RNA的表达转化为每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本，并将56例患者转录组测序得到的基因集和基因表达矩阵命名为“Tianjin”数据集[5]。
1.2.2 基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）、癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库检索
检索GEO，共得到4个包含较大MPNST样本量的转录组测序数据集，分别为GSE141438 RNA测序 ［7例MPNST，7例正常，3例神经纤维瘤（neurofibromatosis，NF）］、GSE145064 RNA测序 ［25例MPNST，21例丛状神经纤维瘤（plexiform neurofibromas，PNF）］、GSE140987 MicroRNA（10例散发，9例PNF，9例MPNST）、GSE66743芯片（30例MPNST，8例NF）。TCGA数据库中，根据组织来源不同，检索得到包含脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、未分化多形性肉瘤、黏液纤维肉瘤、MPNST和滑膜肉瘤等肉瘤亚型共计263例肉瘤样本及2例正常组织样本相关信息。
1.2.3 基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）及基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）
使用GSVA包（v1.34.0）和R中的pheatmap包（v1.0.12）对Tianjin和GSE141438数据集进行GSVA和GSEA分析，筛选转录水平表达升高的通路。并对筛选得到的通路取交集，得到差异表达基因。
1.2.4 蛋白间互作网络（Protein-Protein interaction networks，PPI）构建及Cytoscape软件可视化
使用STRING 11.5数据库（https://string-db.org/）预测通路分析得到的差异基因编码PPI。设置“minimum required interaction score”为0.4。利用Cytoscape v3.7.0软件（NDEX公司，美国）将上述结果可视化。
1.3 差异表达分析
根据TCGA数据库中的肉瘤及正常组织样本转录组测序数据，分析CDK1 mRNA在肉瘤与正常组织中的表达差异。选择包含生存信息的Tianjin数据集和GSE141438数据集，分析CDK1 mRNA在MPNST与正常组织中的表达水平差异。进一步分析GSE66743、GSE145064数据集中CDK1 mRNA在MPNST与NF组织和PNF组织表达水平差异。利用TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064这4个数据集对比其他CDK家族成员（CDK2～8）在MPNST与正常组织、NF组织、PNF组织中的mRNA表达水平。
1.4 免疫组织化学染色观察
取56例MPNST患者组织样本，经甲醛固定、石蜡包埋后构建组织微矩阵（经病理科专业医师再次确认并核对病理结果后，标记典型肿瘤区域进行组织芯片制作）。按常规方法行CDK1免疫组织化学染色，从每个组织中随机挑选10个视野，根据免疫组织化学染色结果评分标准[6]，对每个视野中的CDK1阳性细胞进行计数。实验采用双盲法，由至少2名病理学专家进行评定。并计算CDK1蛋白表达率，公式：CDK1阳性细胞数/肿瘤细胞总数×100%。
1.5 生存分析及生存风险评估
根据CDK1 mRNA在病变组织中表达的中位值将患者分为低表达组和高表达组；根据56例MPNST患者组织微矩阵免疫组织化学染色结果将患者分为CDK1蛋白阳性（CDK1-positive）组与CDK1蛋白阴性（CDK1-negative）组；通过Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验比较组间患者生存差异，并绘制患者Kaplan-Meier生存曲线。
1.6 统计学方法
采用R studio、R 4.2.2软件及SPSS25.0、GraphPad Prism 8软件进行统计分析和绘图，利用Cytoscape v3.7.0软件进行PPI结果可视化。计量资料经正态性检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。检验水准取双侧α=0.05。
2 结果
2.1 CDK1 为筛选得到的枢纽基因
对Tianjin数据集转录组测序结果通路分析，GSVA分析发现相较于正常组织，MPNST中表达升高的基因在E2F、G2M、EMT 3条通路显著富集。GSEA分析同样发现，与正常组织相比，MPNST表达升高的基因在E2F、G2M、EMT 3条通路显著富集。见图1a～c。通过分析GSE141438数据集，GSVA、GSEA均发现转录水平表达升高的基因在E2F和G2M 2条通路显著富集。见图1d～f。
图1
CDK1 mRNA表达水平检测
a. 聚类热图示Tianjin数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；b、c. GSEA分析示Tianjin数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；d. 聚类热图示GSE141438数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；e、f. GSEA分析示GSE141438数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；g. PPI分析示CDK1蛋白是节点数最高的节点蛋白；h. Cytoscape软件可视化查找得到CDK1为枢纽基因
Figure1. Detection of CDK1 mRNA expressiona. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; b, c. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; d. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; e, f. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; g. PPI analysis revealed that CDK1 protein was the node protein with the highest number of connections; h. Cytoscape software visualizes and identifies CDK1 as a hub gene
对Tianjin数据集及GSE141438数据集中整体表达均升高的2条通路（E2F、G2M）取交集，共得到25个差异表达基因。PPI分析表明，CDK1蛋白的节点数为20（图1g）；并利用Cytoscape软件进行可视化，发现CDK1基因的关联强度高于其他差异表达基因，CDK1为枢纽基因（图1h）。
2.2 CDK1 mRNA表达水平在肉瘤、MPNST中显著升高
TCGA包含的263例肉瘤样本中CDK1 mRNA表达水平较2例正常组织样本显著上升（P<0.05）；Tianjin、GSE141438数据集中MPNST相较于正常组织，CDK1 mRNA表达显著上升（P<0.05）。见图2a～c。
图2
CDK1 在肉瘤、MPNST组织中的表达情况及其表达高低与预后的关系
a. TCGA数据库中CDK1 mRNA表达 *
a. CDK1 mRNA expression in the TCGA database *
2.3 肉瘤、MPNST中CDK1 蛋白、mRNA表达水平与患者预后关系
免疫组织化学染色示，CDK1蛋白在MPNST组织中的表达率为40.31%。结合患者临床随访信息，根据CDK1蛋白在肿瘤组织中阳性表达水平将患者分为CDK1-positive组（n=4）和CDK1-negative组（n=36）。生存分析结果表明CDK1-positive组与CDK1-negative组中位总生存期分别为25.19个月和33.30个月，差异无统计学意义（P>0.05）。CDK1-positive组整体生存趋势较CDK1-negative组差。见图2d～f。
在CDK1 mRNA表达水平层面，Kaplan-Meier生存分析示，TCGA数据库和GSE66743数据集中的肉瘤、MPNST患者CDK1高表达组生存时间与低表达组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。在TCGA的263例肉瘤数据中，共有259例肉瘤患者有生存数据，CDK1 mRNA高表达组（n=130）和低表达组（n=129）中位总生存期分别为4.75年和6.75年，差异有统计学意义（P<0.05）。GSE66743数据集中29例MPNST患者CDK1 mRNA高表达组（n=16）与低表达组（n=13）中位总生存期分别为19 个月和NA，差异有统计学意义（P<0.05）。263例肉瘤患者样本中包含9例MPNST样本（CDK1高表达组n=5，低表达组n=4），Kaplan-Meier生存分析示差异无统计学意义（P>0.05），可能与样本量较小有关，但生存曲线整体趋势仍显示CDK1高表达组患者预后较差。见图2g～i。
2.4 CDK1和其他CDK家族在MPNST中表达特点
与NF和PNF组织相比，CDK1 mRNA的表达在MPNST患者中显著上调 ［GSE66743、GSE145064数据集（P<0.05）］。GSE66743数据集中CDK2 mRNA在MPNST和NF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；GSE66743、GSE145064数据集中CDK3 mRNA在MPNST与NF及PNF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；TCGA数据库中CDK4 mRNA在肉瘤组织与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；GSE145064数据集中CDK5 mRNA在MPNST与PNF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05），TCGA数据库中CDK5 mRNA在肉瘤与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；GSE145064数据集、GSE66743数据集和TCGA数据库中CDK6 mRNA在MPNST与NF、PNF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05），在肉瘤与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064数据集中CDK7 mRNA在MPNST与正常、NF、PNF组织中表达差异均无统计学意义（P>0.05），在肉瘤与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064数据集中CDK8 mRNA在MPNST与正常、NF、PNF组织中表达差异均无统计学意义（P>0.05），在肉瘤组织中表达低于正常组织，但差异无统计学意义（P>0.05）。因此，在转录组水平上，CDK家族成员中只有CDK1在MPNST中表达与正常组织、NF组织和PNF组织差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3、4。
图3
CDK1～4 mRNA在各组织中的表达情况 *P<0.05
a. GSE66743数据集中CDK1 mRNA表达；b. GSE145064数据集中CDK1 mRNA表达；c～f. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中CDK2 mRNA表达；g～i. Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中CDK3 mRNA表达；j～m. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中CDK4 mRNA表达
Figure3. Expression of CDK1-4 mRNA in various tissues *P<0.05a. Expression of CDK1 mRNA in the GSE66743 dataset; b. Expression of CDK1 mRNA in the GSE145064 dataset; c-f. Expression of CDK2 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; g-i. Expression of CDK3 mRNA in the Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; j-m. Expression of CDK4 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets
图4
CDK5～8 mRNA在各组织中的表达情况 *P<0.05
从左至右依次为TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中 a. CDK5 mRNA；b. CDK6 mRNA；c. CDK7 mRNA；d. CDK8 mRNA
Figure4. Expression of CDK5-8 mRNA in various tissues *P<0.05From left to right for TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets, respectively a. CDK5 mRNA; b. CDK6 mRNA; c. CDK7 mRNA; d. CDK8 mRNA
3 讨论
CDK1蛋白是细胞周期调控的关键酶，本研究进一步表明其在MPNST中扮演着重要角色。既往研究表明，CDK1在诸多瘤种中的高表达与肿瘤的快速增殖、侵袭性增高和较差的预后密切相关[2，7-10]。基于转录组测序和生物信息学分析，我们发现CDK1在MPNST肿瘤样本中的转录水平显著高于正常组织，这一发现得到了公共数据集的支持。CDK1的异常高表达通常伴随着肿瘤细胞增殖加速和恶性行为的增强。本研究进一步行生存分析显示，存在CDK1转录上调的MPNST患者其生存时间显著低于低表达组，MPNST组织中CDK1蛋白表达阳性患者生存趋势较表达阴性患者差。提示CDK1可能是影响MPNST患者预后的重要因素。这些研究结果不仅揭示了CDK1在MPNST中的关键作用，还表明其表达水平可以作为评估MPNST患者预后的潜在生物标志物。
CDK1在多个瘤种中被证实是参与肿瘤发生、发展的关键因子。研究表明[9，11]，CDK1高表达与胰腺导管细胞癌患者较差的预后相关，靶向CDK1能够通过诱导G2/M期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤干细胞等方式治疗胰腺导管细胞癌。本研究结果显示CDK1 mRNA在MPNST中的转录上调与较差的预后相关，且相较于其他CDK家族成员，CDK1在MPNST中表现出独特的表达模式。我们分析CDK1可能是MPNST发生、发展过程中的关键分子，CDK1作为MPNST潜在的治疗靶点具有良好研究前景。
CDK1是如何影响MPNST发生、发展的具体机制目前仍未明确。Xu等[12]的研究表明，CDK1表达水平与胰腺导管细胞癌预后相关，敲低CDK1表达会导致胰腺癌细胞肿瘤干性降低并使肿瘤干细胞亚群减少，具体机制是通过调节CDK1的翻译后修饰，即减少组蛋白去乙酰化酶介导的CDK1去乙酰化，从而减少STAT3的磷酸化来实现的。此外，富含丝氨酸/精氨酸剪接因子9（SRSF9）、癌高甲基化因子1（HIC1）、丙酮酸激酶同工酶M2型（PKM2）、长链酰基辅酶A合酶 4 （ASCL-4）、去泛素化酶YOD1等因子也在胶质瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌和三阴性乳腺癌中分别通过不同途径来调控CDK1表达，进而影响细胞周期进程来影响肿瘤细胞增殖能力、耐药性等[13-17]。基于上述研究结果， CDK1上下游相关分子也可能通过直接与CDK1启动子区域结合、表观遗传修饰、减少铁死亡等途径调控MPNST细胞恶性增殖。CDK1的这些多重作用机制揭示了其在MPNST发生和进展中的核心地位，表明其异常活性可能是导致MPNST细胞逃避正常细胞周期控制和加速肿瘤发展的关键因素。
本研究结果表明，CDK家族中仅有CDK1在MPNST中的转录相较于正常组织、NF组织和PNF组织均上调，然而本次组织微阵列中免疫组织化学染色阳性表达CDK1蛋白的患者较少，与CDK1 mRNA在MPNST组织中的高表达存在明显差异。我们分析这种差异是由于CDK1蛋白上、下游存在潜在调节机制亦或是免疫组织化学染色操作等原因造成的。在今后的研究中，我们将重点就CDK1 mRNA的表观遗传修饰以及CDK1蛋白的翻译后修饰进行研究，探寻CDK1 mRNA和蛋白上、下游的具体调节机制。同时，细胞周期的调控复杂多样，无法忽视其他CDK家族成员分子以及细胞周期调节因子和CDK1蛋白之间的相互作用关系。不仅CDK1蛋白受到WEE1样蛋白激酶、细胞分裂周期因子（CDC25）等分子对其的磷酸化/去磷酸化调控，研究表明，CDK7也能发挥CDK激酶（CAK）活性磷酸化包含CDK1在内的几种CDK成员[18-19]。因此，其他CDK分子以及参与细胞周期调控因子与CDK1之间的相互作用同样不能被忽略，这也是需要进一步探索研究的关键之一。
鉴于CDK1在MPNST中的关键作用，针对CDK1的抑制成为一种具有潜力的治疗策略。初步研究显示，CDK1抑制剂能够有效阻止MPNST细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡[20]。这些发现为开发新的MPNST治疗方法提供了重要依据。未来研究需要进一步优化CDK1抑制剂的设计，提升其选择性和效力，同时评估其在临床应用中的安全性和有效性。此外，结合现有的化疗和放疗手段，CDK1抑制剂有望增强治疗效果，提高患者生存率。值得注意的是，CDK1不仅在MPNST中表现出关键作用，在多种恶性肿瘤中也显示出相似的机制和潜力。因此，针对CDK1的治疗策略不仅可能为MPNST患者带来新的希望，也有望为其他癌症的治疗提供新思路。通过深入研究CDK1在MPNST中的具体作用机制和其作为治疗靶点的潜力，我们期待未来能够开发出更加精准和有效的治疗方案，显著改善MPNST患者预后，并拓展这一策略在其他肿瘤中的应用。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
伦理声明 研究方案经天津市肿瘤医院（核）医学伦理委员会批准（bc2023111）；患者均签署知情同意书
作者贡献声明 刘源欣：免疫组织化学染色、作图、文章撰写 ；付来华：数据统计分析、临床资料收集整理；刘昊天：研究设计、数据统计分析、作图；张耕溥、肖婉祎：临床资料收集整理；高梓唯、张洪亮：数据统计分析；杨吉龙：研究指导、论文审阅、实验设计、经费支持
恶性周围神经鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一种罕见且具有高度侵袭性的软组织肉瘤，起源于周围神经或其鞘膜，多见于20～50岁人群，占所有软组织肉瘤的5%～10%。该肿瘤的发病与Ⅰ型神经纤维瘤病（neurofibromatosis type 1，NF1）密切相关，约50% MPNST患者发生于NF1患者中。MPNST具有高度恶性特性，易复发和转移，预后较差。尽管手术切除是主要治疗手段，但由于肿瘤的侵袭性和复杂的生物学行为，临床治疗效果有限。
MPNST的相关基因组学分析研究表明，NF1双等位基因的功能性缺失和RAS基因异常激活、CDKN2A基因组位点的杂合性缺失是MPNST细胞发生中上游突变的关键环节[1]。细胞周期蛋白依赖性激酶1（cell-cycle dependent kinase 1，CDK1）作为一种参与调控细胞增殖和迁移、炎症反应、免疫应激的关键因子，已逐渐被国内外学者关注[2]。CDK1作为细胞周期的核心调控因子，其异常表达与多种癌症的发生、发展密切相关，如在乳腺癌、肺癌和胃癌中CDK1为高表达状态，且与肿瘤细胞增殖加快、侵袭性增强和患者预后较差相关[3-4]。
为了研究CDK1在MPNST中的分子生物学特性以及其临床意义，本研究对来自天津市肿瘤医院的MPNST样本和正常组织样本进行了转录组测序，并结合外部数据集进行生物信息学分析，进一步利用免疫组织化学染色分析CDK1蛋白在MPNST组织中的表达情况，为临床治疗策略提供新的方向。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2011年9月—2020年3月于天津市肿瘤医院接受手术切除治疗，并经组织学、病理学证实的56例MPNST患者肿瘤样本及17例正常组织样本（同一MPNST患者距离肿瘤边缘5 cm以上的非肿瘤组织）作为研究对象。其中男32例，女24例；年龄12～82岁，平均51岁。病变位于四肢22例，头颈部1例，躯干14例，内脏7例，其他部位10例。患者入院时39例为原发病灶，17例为复发病灶。其中NF1型患者12例（21.4%）。肿瘤为单发42例，多发14例；肿瘤最大径2.0～18.0 cm，平均7.1 cm，其中<5 cm 21例，5～10 cm 26例，>10 cm 9例。术后复发12例（21.4%），远处转移（远隔部位皮肤、软组织、器官的转移和/或非区域淋巴结转移）13例（23.2%）；接受化疗23例，放疗13例。将切除后的肿瘤和正常组织置入–196℃超低温液氮罐冻存。
1.2 转录组测序及生物信息学分析
1.2.1 转录组测序
取56例MPNST患者的冷冻组织和17例正常组织样本，采用Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）提取RNA，按照MGlEasy mRNA文库试剂盒（深圳华大智造科技股份有限公司）方法构建mRNA文库，在DNBSEO-G400测序仪（深圳华大智造科技股份有限公司）上对PE150循环的mRNA文库进行测序。使用子读取对齐器将读段与人类参考基因组 （GRCh38） 进行比对，在计算机R studio软件中利用edgeR R包对RNA读取计数进行归一化，将每个RNA的表达转化为每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本，并将56例患者转录组测序得到的基因集和基因表达矩阵命名为“Tianjin”数据集[5]。
1.2.2 基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）、癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库检索
检索GEO，共得到4个包含较大MPNST样本量的转录组测序数据集，分别为GSE141438 RNA测序 ［7例MPNST，7例正常，3例神经纤维瘤（neurofibromatosis，NF）］、GSE145064 RNA测序 ［25例MPNST，21例丛状神经纤维瘤（plexiform neurofibromas，PNF）］、GSE140987 MicroRNA（10例散发，9例PNF，9例MPNST）、GSE66743芯片（30例MPNST，8例NF）。TCGA数据库中，根据组织来源不同，检索得到包含脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、未分化多形性肉瘤、黏液纤维肉瘤、MPNST和滑膜肉瘤等肉瘤亚型共计263例肉瘤样本及2例正常组织样本相关信息。
1.2.3 基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）及基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）
使用GSVA包（v1.34.0）和R中的pheatmap包（v1.0.12）对Tianjin和GSE141438数据集进行GSVA和GSEA分析，筛选转录水平表达升高的通路。并对筛选得到的通路取交集，得到差异表达基因。
1.2.4 蛋白间互作网络（Protein-Protein interaction networks，PPI）构建及Cytoscape软件可视化
使用STRING 11.5数据库（https://string-db.org/）预测通路分析得到的差异基因编码PPI。设置“minimum required interaction score”为0.4。利用Cytoscape v3.7.0软件（NDEX公司，美国）将上述结果可视化。
1.3 差异表达分析
根据TCGA数据库中的肉瘤及正常组织样本转录组测序数据，分析CDK1 mRNA在肉瘤与正常组织中的表达差异。选择包含生存信息的Tianjin数据集和GSE141438数据集，分析CDK1 mRNA在MPNST与正常组织中的表达水平差异。进一步分析GSE66743、GSE145064数据集中CDK1 mRNA在MPNST与NF组织和PNF组织表达水平差异。利用TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064这4个数据集对比其他CDK家族成员（CDK2～8）在MPNST与正常组织、NF组织、PNF组织中的mRNA表达水平。
1.4 免疫组织化学染色观察
取56例MPNST患者组织样本，经甲醛固定、石蜡包埋后构建组织微矩阵（经病理科专业医师再次确认并核对病理结果后，标记典型肿瘤区域进行组织芯片制作）。按常规方法行CDK1免疫组织化学染色，从每个组织中随机挑选10个视野，根据免疫组织化学染色结果评分标准[6]，对每个视野中的CDK1阳性细胞进行计数。实验采用双盲法，由至少2名病理学专家进行评定。并计算CDK1蛋白表达率，公式：CDK1阳性细胞数/肿瘤细胞总数×100%。
1.5 生存分析及生存风险评估
根据CDK1 mRNA在病变组织中表达的中位值将患者分为低表达组和高表达组；根据56例MPNST患者组织微矩阵免疫组织化学染色结果将患者分为CDK1蛋白阳性（CDK1-positive）组与CDK1蛋白阴性（CDK1-negative）组；通过Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验比较组间患者生存差异，并绘制患者Kaplan-Meier生存曲线。
1.6 统计学方法
采用R studio、R 4.2.2软件及SPSS25.0、GraphPad Prism 8软件进行统计分析和绘图，利用Cytoscape v3.7.0软件进行PPI结果可视化。计量资料经正态性检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的数据以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。检验水准取双侧α=0.05。
2 结果
2.1 CDK1 为筛选得到的枢纽基因
对Tianjin数据集转录组测序结果通路分析，GSVA分析发现相较于正常组织，MPNST中表达升高的基因在E2F、G2M、EMT 3条通路显著富集。GSEA分析同样发现，与正常组织相比，MPNST表达升高的基因在E2F、G2M、EMT 3条通路显著富集。见图1a～c。通过分析GSE141438数据集，GSVA、GSEA均发现转录水平表达升高的基因在E2F和G2M 2条通路显著富集。见图1d～f。
图1
CDK1 mRNA表达水平检测
a. 聚类热图示Tianjin数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；b、c. GSEA分析示Tianjin数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；d. 聚类热图示GSE141438数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；e、f. GSEA分析示GSE141438数据集中表达升高的基因在E2F、G2M通路显著富集；g. PPI分析示CDK1蛋白是节点数最高的节点蛋白；h. Cytoscape软件可视化查找得到CDK1为枢纽基因
Figure1. Detection of CDK1 mRNA expressiona. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; b, c. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the Tianjin dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; d. The cluster heatmap illustrated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; e, f. GSEA analysis indicated that genes with elevated expression in the GSE141438 dataset significantly enriched in the E2F and G2M pathways; g. PPI analysis revealed that CDK1 protein was the node protein with the highest number of connections; h. Cytoscape software visualizes and identifies CDK1 as a hub gene
对Tianjin数据集及GSE141438数据集中整体表达均升高的2条通路（E2F、G2M）取交集，共得到25个差异表达基因。PPI分析表明，CDK1蛋白的节点数为20（图1g）；并利用Cytoscape软件进行可视化，发现CDK1基因的关联强度高于其他差异表达基因，CDK1为枢纽基因（图1h）。
2.2 CDK1 mRNA表达水平在肉瘤、MPNST中显著升高
TCGA包含的263例肉瘤样本中CDK1 mRNA表达水平较2例正常组织样本显著上升（P<0.05）；Tianjin、GSE141438数据集中MPNST相较于正常组织，CDK1 mRNA表达显著上升（P<0.05）。见图2a～c。
图2
CDK1 在肉瘤、MPNST组织中的表达情况及其表达高低与预后的关系
a. TCGA数据库中CDK1 mRNA表达 *
a. CDK1 mRNA expression in the TCGA database *
2.3 肉瘤、MPNST中CDK1 蛋白、mRNA表达水平与患者预后关系
免疫组织化学染色示，CDK1蛋白在MPNST组织中的表达率为40.31%。结合患者临床随访信息，根据CDK1蛋白在肿瘤组织中阳性表达水平将患者分为CDK1-positive组（n=4）和CDK1-negative组（n=36）。生存分析结果表明CDK1-positive组与CDK1-negative组中位总生存期分别为25.19个月和33.30个月，差异无统计学意义（P>0.05）。CDK1-positive组整体生存趋势较CDK1-negative组差。见图2d～f。
在CDK1 mRNA表达水平层面，Kaplan-Meier生存分析示，TCGA数据库和GSE66743数据集中的肉瘤、MPNST患者CDK1高表达组生存时间与低表达组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。在TCGA的263例肉瘤数据中，共有259例肉瘤患者有生存数据，CDK1 mRNA高表达组（n=130）和低表达组（n=129）中位总生存期分别为4.75年和6.75年，差异有统计学意义（P<0.05）。GSE66743数据集中29例MPNST患者CDK1 mRNA高表达组（n=16）与低表达组（n=13）中位总生存期分别为19 个月和NA，差异有统计学意义（P<0.05）。263例肉瘤患者样本中包含9例MPNST样本（CDK1高表达组n=5，低表达组n=4），Kaplan-Meier生存分析示差异无统计学意义（P>0.05），可能与样本量较小有关，但生存曲线整体趋势仍显示CDK1高表达组患者预后较差。见图2g～i。
2.4 CDK1和其他CDK家族在MPNST中表达特点
与NF和PNF组织相比，CDK1 mRNA的表达在MPNST患者中显著上调 ［GSE66743、GSE145064数据集（P<0.05）］。GSE66743数据集中CDK2 mRNA在MPNST和NF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；GSE66743、GSE145064数据集中CDK3 mRNA在MPNST与NF及PNF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；TCGA数据库中CDK4 mRNA在肉瘤组织与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；GSE145064数据集中CDK5 mRNA在MPNST与PNF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05），TCGA数据库中CDK5 mRNA在肉瘤与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；GSE145064数据集、GSE66743数据集和TCGA数据库中CDK6 mRNA在MPNST与NF、PNF组织中表达差异无统计学意义（P>0.05），在肉瘤与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064数据集中CDK7 mRNA在MPNST与正常、NF、PNF组织中表达差异均无统计学意义（P>0.05），在肉瘤与正常组织中表达差异无统计学意义（P>0.05）；Tianjin、TCGA、GSE66743、GSE145064数据集中CDK8 mRNA在MPNST与正常、NF、PNF组织中表达差异均无统计学意义（P>0.05），在肉瘤组织中表达低于正常组织，但差异无统计学意义（P>0.05）。因此，在转录组水平上，CDK家族成员中只有CDK1在MPNST中表达与正常组织、NF组织和PNF组织差异均有统计学意义（P<0.05）。见图3、4。
图3
CDK1～4 mRNA在各组织中的表达情况 *P<0.05
a. GSE66743数据集中CDK1 mRNA表达；b. GSE145064数据集中CDK1 mRNA表达；c～f. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中CDK2 mRNA表达；g～i. Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中CDK3 mRNA表达；j～m. TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中CDK4 mRNA表达
Figure3. Expression of CDK1-4 mRNA in various tissues *P<0.05a. Expression of CDK1 mRNA in the GSE66743 dataset; b. Expression of CDK1 mRNA in the GSE145064 dataset; c-f. Expression of CDK2 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; g-i. Expression of CDK3 mRNA in the Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets; j-m. Expression of CDK4 mRNA in the TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets
图4
CDK5～8 mRNA在各组织中的表达情况 *P<0.05
从左至右依次为TCGA、Tianjin、GSE66743和GSE145064数据集中 a. CDK5 mRNA；b. CDK6 mRNA；c. CDK7 mRNA；d. CDK8 mRNA
Figure4. Expression of CDK5-8 mRNA in various tissues *P<0.05From left to right for TCGA, Tianjin, GSE66743, and GSE145064 datasets, respectively a. CDK5 mRNA; b. CDK6 mRNA; c. CDK7 mRNA; d. CDK8 mRNA
3 讨论
CDK1蛋白是细胞周期调控的关键酶，本研究进一步表明其在MPNST中扮演着重要角色。既往研究表明，CDK1在诸多瘤种中的高表达与肿瘤的快速增殖、侵袭性增高和较差的预后密切相关[2，7-10]。基于转录组测序和生物信息学分析，我们发现CDK1在MPNST肿瘤样本中的转录水平显著高于正常组织，这一发现得到了公共数据集的支持。CDK1的异常高表达通常伴随着肿瘤细胞增殖加速和恶性行为的增强。本研究进一步行生存分析显示，存在CDK1转录上调的MPNST患者其生存时间显著低于低表达组，MPNST组织中CDK1蛋白表达阳性患者生存趋势较表达阴性患者差。提示CDK1可能是影响MPNST患者预后的重要因素。这些研究结果不仅揭示了CDK1在MPNST中的关键作用，还表明其表达水平可以作为评估MPNST患者预后的潜在生物标志物。
CDK1在多个瘤种中被证实是参与肿瘤发生、发展的关键因子。研究表明[9，11]，CDK1高表达与胰腺导管细胞癌患者较差的预后相关，靶向CDK1能够通过诱导G2/M期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤干细胞等方式治疗胰腺导管细胞癌。本研究结果显示CDK1 mRNA在MPNST中的转录上调与较差的预后相关，且相较于其他CDK家族成员，CDK1在MPNST中表现出独特的表达模式。我们分析CDK1可能是MPNST发生、发展过程中的关键分子，CDK1作为MPNST潜在的治疗靶点具有良好研究前景。
CDK1是如何影响MPNST发生、发展的具体机制目前仍未明确。Xu等[12]的研究表明，CDK1表达水平与胰腺导管细胞癌预后相关，敲低CDK1表达会导致胰腺癌细胞肿瘤干性降低并使肿瘤干细胞亚群减少，具体机制是通过调节CDK1的翻译后修饰，即减少组蛋白去乙酰化酶介导的CDK1去乙酰化，从而减少STAT3的磷酸化来实现的。此外，富含丝氨酸/精氨酸剪接因子9（SRSF9）、癌高甲基化因子1（HIC1）、丙酮酸激酶同工酶M2型（PKM2）、长链酰基辅酶A合酶 4 （ASCL-4）、去泛素化酶YOD1等因子也在胶质瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌和三阴性乳腺癌中分别通过不同途径来调控CDK1表达，进而影响细胞周期进程来影响肿瘤细胞增殖能力、耐药性等[13-17]。基于上述研究结果， CDK1上下游相关分子也可能通过直接与CDK1启动子区域结合、表观遗传修饰、减少铁死亡等途径调控MPNST细胞恶性增殖。CDK1的这些多重作用机制揭示了其在MPNST发生和进展中的核心地位，表明其异常活性可能是导致MPNST细胞逃避正常细胞周期控制和加速肿瘤发展的关键因素。
本研究结果表明，CDK家族中仅有CDK1在MPNST中的转录相较于正常组织、NF组织和PNF组织均上调，然而本次组织微阵列中免疫组织化学染色阳性表达CDK1蛋白的患者较少，与CDK1 mRNA在MPNST组织中的高表达存在明显差异。我们分析这种差异是由于CDK1蛋白上、下游存在潜在调节机制亦或是免疫组织化学染色操作等原因造成的。在今后的研究中，我们将重点就CDK1 mRNA的表观遗传修饰以及CDK1蛋白的翻译后修饰进行研究，探寻CDK1 mRNA和蛋白上、下游的具体调节机制。同时，细胞周期的调控复杂多样，无法忽视其他CDK家族成员分子以及细胞周期调节因子和CDK1蛋白之间的相互作用关系。不仅CDK1蛋白受到WEE1样蛋白激酶、细胞分裂周期因子（CDC25）等分子对其的磷酸化/去磷酸化调控，研究表明，CDK7也能发挥CDK激酶（CAK）活性磷酸化包含CDK1在内的几种CDK成员[18-19]。因此，其他CDK分子以及参与细胞周期调控因子与CDK1之间的相互作用同样不能被忽略，这也是需要进一步探索研究的关键之一。
鉴于CDK1在MPNST中的关键作用，针对CDK1的抑制成为一种具有潜力的治疗策略。初步研究显示，CDK1抑制剂能够有效阻止MPNST细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡[20]。这些发现为开发新的MPNST治疗方法提供了重要依据。未来研究需要进一步优化CDK1抑制剂的设计，提升其选择性和效力，同时评估其在临床应用中的安全性和有效性。此外，结合现有的化疗和放疗手段，CDK1抑制剂有望增强治疗效果，提高患者生存率。值得注意的是，CDK1不仅在MPNST中表现出关键作用，在多种恶性肿瘤中也显示出相似的机制和潜力。因此，针对CDK1的治疗策略不仅可能为MPNST患者带来新的希望，也有望为其他癌症的治疗提供新思路。通过深入研究CDK1在MPNST中的具体作用机制和其作为治疗靶点的潜力，我们期待未来能够开发出更加精准和有效的治疗方案，显著改善MPNST患者预后，并拓展这一策略在其他肿瘤中的应用。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
伦理声明 研究方案经天津市肿瘤医院（核）医学伦理委员会批准（bc2023111）；患者均签署知情同意书
作者贡献声明 刘源欣：免疫组织化学染色、作图、文章撰写 ；付来华：数据统计分析、临床资料收集整理；刘昊天：研究设计、数据统计分析、作图；张耕溥、肖婉祎：临床资料收集整理；高梓唯、张洪亮：数据统计分析；杨吉龙：研究指导、论文审阅、实验设计、经费支持
