骨质疏松症是一种常见的全身性骨骼疾病，其特点是骨矿物质密度低和骨质微结构退化，从而降低了骨强度，脆性骨折风险增加[1]，目前临床尚缺少安全、有效的治疗手段。骨量是通过成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的持续骨重塑来控制，如两者之间平衡打破，骨形成速度低于骨吸收，就会导致骨质疏松症。BMSCs由祖细胞和多能骨骼干细胞组成，可在体外分化为成骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[2]。目前，研究表明几乎所有成骨细胞都来源于BMSCs[3]，由于BMSCs可分化成骨骼细胞表型，因此被认为是最理想的骨代谢研究对象[4]。
脊椎蛋白（R-spondin，Rspo）家族由4种分泌型糖蛋白（Rspo1～4）组成[5]，与发育和癌症等许多疾病病理性改变密切相关[6-7]。研究显示小鼠体内缺失Rspo受体LGR4会导致骨形成减少和骨吸收增加，发生骨质丢失，表明Rspo表达对维持骨代谢稳态至关重要[8]。Rspo2基因敲除小鼠表现出面部骨骼缺陷、远端肢体缺失和肺发育不全[9]。此外，骨关节炎患者体内的Rspo2 mRNA和蛋白表达量均减少，Rspo2表达下调会抑制体内成骨细胞矿化，且重组Rspo2则能提高此类患者成骨细胞矿化度[10]。然而，Rspo2对BMSCs诱导骨形成和分化的影响尚不清楚，为此本次研究旨在探究Rspo2在体外和体内对BMSCs向成骨分化的影响和其具体作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
雌性C57BL/6小鼠25只，其中10周龄小鼠18只，体质量21～24 g；4周龄小鼠7只，体质量12～14 g；均由华阜康生物科技股份有限公司提供。实验前适应性喂养1周，分笼饲养，每笼最多5只，自由饮食、饮水，光照时间12 h/d，温度25℃。
α-MEM培养基、FBS、青霉素溶液、硫酸链霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA 溶液（GIBCO公司，美国）；Rspo2重组蛋白（R&D公司，美国）；HE染色液（Sigma-Aldrich公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；江苏凯基生物技术股份有限公司）；抗Runx2抗体（Abcam公司，美国）；抗CD29、CD105、CD34、CD45流式抗体（BioLegend公司，美国）；FACS缓冲液（BD Biosciences公司，美国）；ALP染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol试剂（Life Technologies公司，美国）； PrimeScript RT逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa公司，日本）；羊抗鼠IgG2b-HRP二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司）；DAB显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；ELISA 检测试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）。
超速离心机（Beckman公司，美国）；酶标仪（Omega公司，德国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；Micro-CT（Scanco Medical公司，瑞士）；Image-Pro Plus软件（Media Cybernetics公司，美国）；GraphPad Prism软件（GraphPad Software公司，美国）。
1.2 体外实验
1.2.1 BMSCs分离培养及鉴定
取7只4周龄小鼠，过量麻醉处死后置于75%乙醇5 min；分离股骨及胫骨，剪开长骨两端，以适量α-MEM培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液；以离心半径13 cm、
取对数生长期第3代细胞行细胞表型鉴定，流式细胞学检测示细胞表型标志物CD29、CD105阳性表达，表达率分别为96.38%、97.81%；CD34、CD45阴性表达，表达率分别为1.26%、0.82%。分离培养细胞符合MSCs表达特性，取第3代细胞用于下一步实验。
1.2.2 Rspo2对BMSCs活性的影响
取BMSCs以1×104个/孔密度接种于96孔板，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24 h后，分别加入浓度为10、20、40、80和100 nmol/L的Rspo2共培养24 h；每个浓度取6孔细胞，采用CCK-8法观测增殖情况，记录450 nm处吸光度（A）值，取均值。观察不同浓度Rspo2处理后BMSCs增殖差异，筛选不影响细胞活性浓度的Rspo2进行后续实验。并选取24 h细胞活性最强的浓度组连续培养24、48、72 h，观察Rspo2对BMSCs增殖影响。
1.2.3 Rspo2对BMSCs成骨能力的影响
将BMSCs以1×106个/孔接种于12孔板，孔板中分别滴加筛选的不同浓度Rspo2以及含15%FBS的α-MEM培养基；于37℃、5%CO2 孵箱中培养5 d后，加入25 μg/mL维生素C和5 mmol/L β-甘油磷酸以诱导成骨分化；诱导培养7 d后，取细胞进行ALP染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。以正常培养BMSCs作为对照。
① ALP染色：将细胞固定于10%甲醛15 min，PBS清洗3遍后加入ALP染色液，室温下孵育30 min后移除染色液，光镜下观察呈蓝紫色的阳性细胞，采用Image-Pro Plus软件测量ALP阳性细胞面积。实验重复3次。
② RT-qPCR检测：取细胞采用TRIzol试剂分离总RNA后，以PrimeScript RT逆转录试剂盒转化为cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行RCR扩增。热循环条件：95℃初始变性30 s，95℃ 5 s、60℃ 20 s、72℃ 15 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2–ΔΔCt方法计算成骨相关基因RUNX家族转录因子2（RUNX family transcription factor 2，Runx2）、Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ alpha 1，Col1）、骨钙素（osteocalcin，OCN）相对表达量。实验重复3次。引物序列见表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5’ →3’）
Table1.
Primer sequences of genes in qRT-PCR（5’ →3’）
1.3 动物实验
1.3.1 动物模型制备及分组
取18只10周龄小鼠随机分为3组：假手术组、卵巢去势（ovariectomy，OVX）组和OVX+Rspo2组，每组6只。腹腔注射10%水合氯醛（0.04 mL/10 g）麻醉后，假手术组仅行双侧背部切开缝合，其余两组通过双侧OVX建立骨质疏松模型。术后OVX+Rspo2组每周腹腔注射Rspo2（1 mg/kg）[11]，假手术组和OVX组接受相同剂量生理盐水。干预12周后，3组采用心脏取血方法获得全血，处死后取胫骨、子宫进行观测。
1.3.2 观测指标
① 一般情况：观察术后各组小鼠存活情况，称重小鼠体质量及子宫质量，评估OVX模型制备是否成功。
② 组织学及免疫组织化学染色： 将部分小鼠胫骨按顺序分别置于4%多聚甲醛4℃固定24 h、15%乙二胺四乙酸（pH7.2）脱钙14 d后，石蜡包埋、切片（片厚2～5 μm）。取部分切片行常规HE染色，光镜下观察骨小梁数量、排列疏松度及连接性。剩余切片脱蜡水化后PBS洗涤，3%H2O2中孵育30 min以抑制内源性过氧化物酶活性，然后应用Runx2一抗（1∶200）4℃孵育过夜，PBS洗涤后应用羊抗鼠IgG2b-HRP二抗室温下孵育1 h，DAB显色；光镜下观察阳性染色细胞，Image-Pro Plus软件对Runx2阳性细胞进行定量分析。
③ ELISA检测：将小鼠全血以离心半径13cm、1 200 r/min离心10 min，取血清按ELISA检测试剂盒标准操作步骤，检测小鼠血清骨代谢标记物ALP、OCN、Ⅰ型前胶原氨基端肽（type Ⅰ procollagen amino-terminal peptide，PINP）以及骨吸收标记物β胶原降解产物（β-isomerized C-telopeptide，β-CTX）含量。
④ Micro-CT 检测：将剩余小鼠胫骨置于4%多聚甲醛固定过夜后行Micro-CT扫描分析。扫描参数：电压89 kV、电流112 μA、厚度20 μm。采用自带SCANCO Evaluation软件对胫骨截面图像行三维组织形态计量分析，包括骨小梁厚度（trabeculae thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabeculae number，Tb.N）、骨小梁分离度（trabeculae separation，Tb.Sp）和骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 体外实验
2.1.1 Rspo2对BMSCs活性的影响
CCK-8检测示，培养24 h后10、20、40、80 nmol/L Rspo2组A值与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；仅100 nmol/L Rspo2组A值低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。随培养时间延长，20 nmol/L Rspo2组A值逐渐升高，其中72 h时A值明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。基于上述结果，选择10、20和40 nmol/L Rspo2进行后续实验。
图1
CCK-8检测Rspo2对BMSCs活性影响
*
*
2.1.2 Rspo2对BMSCs成骨能力的影响
① ALP染色：成骨诱导培养7 d后，镜下观察阳性细胞的细胞膜和细胞质内均可见大量散在、深染的蓝紫色颗粒，叠加成结节状。各浓度Rspo2组阳性细胞面积明显大于对照组，其中20 nm/L Rspo2组最高，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图2a、b。
图2
Rspo2对BMSCs成骨分化的影响
*
*
② RT-qPCR检测：各浓度Rspo2组中成骨相关基因相对表达量均高于对照组。其中，10、20 nmol/L Rspo2组Runx2、Col1和OCN以及40 nmol/L Rspo2组Col1和OCN与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2c。
2.2 动物实验
2.2.1 一般情况
各组小鼠术后均存活至实验完成。干预12周后，OVX组、OVX+Rspo2组小鼠体质量均较假手术组增加，但OVX+Rspo2组低于OVX组，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。OVX组、OVX+Rspo2组子宫质量低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）；OVX+Rspo2组较OVX组有所增加，但组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。上述结果提示小鼠OVX模型制备成功。
图3
小鼠体质量及子宫质量比较
*
*
2.2.2 组织学及免疫组织化学染色
HE染色示，与假手术组相比，OVX组小鼠骨小梁排列疏松、骨小梁宽度增加、数量减少且小梁间连接性差，而OVX+Rspo2组这一现象明显改善。见图4a。
图4
小鼠胫骨组织学及免疫组织化学染色观察（×20）
从左至右分别为假手术组、OVX组、OVX+Rspo2组 a. HE染色；b. Runx2免疫组织化学染色
Figure4. Histological and immunohistochemical staining of mice tibia (×20)From left to right for sham group, OVX group, and OVX+Rspo2 group, respectively a. HE staining; b. Runx2 immunohistochemical staining
免疫组织化学染色示，假手术组、OVX组以及OVX+Rspo2组Runx2表达分别为62.98±5.73、23.83±6.65、38.52±6.05。与假手术组相比OVX组表达降低，而OVX+Rspo2组经Rspo2干预后表达较OVX组增加，但尚未达假手术组水平，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4b。
2.2.3 ELISA检测
① 骨代谢标记物：与假手术组相比，OVX组ALP表达升高、PINP表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）；OCN组间差异无统计学意义（P>0.05）。OVX+Rspo2组经Rspo2干预后，PINP表达得到逆转，且ALP、OCN表达亦维持在较高水平，均高于假手术组及OVX组，差异有统计学意义（P<0.05）。② 骨吸收标记物： OVX组β-CTX高于假手术组；OVX+Rspo2组较OVX组明显下降，但尚未达假手术组水平；组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
ELISA检测血清骨代谢及骨吸收标记物表达
*
*
2.2.4 Micro-CT 检测
与假手术组相比，OVX组Tb.Th、Tb.N和BV/TV降低，而Tb.Sp增高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与OVX组相比，OVX+Rspo2组BV/TV、Tb.N增高、Tb.Sp降低，差异有统计学意义（P<0.05）；Tb.Th组间差异无统计学意义（P>0.05）。OVX+Rspo2组BV/TV、Tb.Th仍低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）；Tb.N和Tb.Sp与假手术组差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。
图6
小鼠胫骨Micro-CT检测
a. 胫骨三维重建图 从左至右分别为假手术组、OVX组、OVX+Rspo2组； b. 骨参数定量分析 *
a. Three-dimensional reconstruction of tibia From left to right for sham group, OVX group, and OVX+Rspo2 group, respectively; b. Quantitative analysis of bone parameters *
3 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的疾病，其特征是骨密度和骨量下降，正在引起严重社会问题[12]。骨质疏松症的主要病因尚不清楚，包括内分泌、营养和遗传因素在内的各种病因都会导致骨质疏松[13]。其临床治疗主要包括抗骨吸收和促骨形成药物，尽管这些药物可以延缓骨质疏松症的发展，但双磷酸盐和特立帕肽在治疗后会损害骨重塑并导致骨坏死[14-15]。在本研究中，我们使用OVX小鼠模型来模拟绝经后骨质疏松症。OVX小鼠骨密度下降主要归因于破骨细胞寿命延长和破骨细胞增加[16]，雌激素水平降低将导致成骨细胞数量和活性降低。使用通过增加成骨细胞增殖或诱导成骨细胞分化和减少破骨细胞数量发挥作用的药物，可以增强骨形成并减骨质疏松症。本研究结果显示，OVX小鼠胫骨区域内骨小梁大片融合，骨小梁稀疏度增加小梁间连接性差，取而代之出现巨大空腔，而Rspo2干预后显著改善了OVX小鼠胫骨骨小梁微结构，骨小梁的密度及小梁间连接性显著改善。这表明Rspo2在OVX诱导的骨丢失过程中对成骨调节起到积极作用。
Rspos是一组由4种相关分泌蛋白组成的蛋白质，在器官发育、成体干细胞存活以及癌症发展中起着关键作用[17]。它们最初被分离为含有血小板反应蛋白结构域的基因，在神经元管的顶板中高表达，因此被称为“反应蛋白”。小鼠Rspo2基因敲除会导致胚胎死亡，这是因为肺和四肢发育存在重大缺陷[18]。一项研究表明，Rspo2通过促进破骨细胞生成来加速骨溶解[19]。骨形成和骨吸收是骨重建过程中发生的两种主要活动，尽管骨吸收的减少可以减缓骨质疏松症的发展，但骨量并不能显著有效地增加来抵抗骨质疏松症导致的病理性骨折频发。因此，在本研究中，我们探讨了Rspo2对体外BMSCs成骨分化和OVX诱导的体内骨丢失的影响。ALP是一种细胞膜相关酶，在矿物沉积的早期提供高浓度的磷酸盐，ALP活性与矿化开始前成骨细胞中细胞外基质的形成相关，并被公认为成骨细胞分化的标志[20]。本研究结果表面，Rspo2干预能显著增加BMSCs成骨分化过程中ALP的表达量，且二者表达在一定程度上呈现正相关趋势，说明Rspo2可能在成骨分化过程中有重要作用。
成骨细胞的分化过程通常分为间充质祖细胞、前成骨细胞和成骨细胞阶段。成骨细胞通常以OCN表达为特征，而成骨前细胞通常被认为表达转录因子Runx2，或者在更晚期的分化阶段同时表达Runx2和锌指蛋白，后者是包括OCN和ALP在内的关键成骨蛋白的主要转录因子[21]。成骨分化是一个复杂过程，导致矿化细胞外基质的形成。大量调节因子参与成骨分化。Runx2是成骨细胞分化的重要转录因子，与关键成骨细胞特异性基因的启动子区域直接相互作用[22]。有研究显示Runx2可能是更年期妇女骨代谢的有用遗传标记，并可能在骨密度中发挥重要作用[23]。OCN是一种编码骨钙素的基因，在骨骼形成和骨质疏松等骨代谢过程中起重要作用[24]。Col1是骨细胞外基质的重要成分，它将细胞表面整合素与其他细胞外基质蛋白连接起来，作为成骨细胞产生的分泌糖蛋白[25]。本研究发现BMSCs成骨分化过程中，Rspo2处理后成骨细胞标记基因Runx2、OCN、ALP和Col1表达量显著提升，说明Rspo2在祖细胞成骨分化中起到重要作用。但骨形成是一个复杂且连续过程，诸多基因及生物因子交互作用，本研究只是明确了Rspo2能够促进祖细胞的成骨分化，但具体作用机制仍需后续研究明确。
综上述，Rspo2通过在组织和细胞水平上调Runx2、ALP和OCN来促进成骨，从而促进BMSCs向成骨细胞谱系分化，进一步支持了Rspo2作为一种潜在的骨质疏松治疗策略的实用性。在未来研究中，我们将进行药代动力学、毒理学分析及随机对照研究，验证Rspo2对于刺激绝经后妇女骨形成以及伴随症状功效，探讨其潜在作用机制。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经研究方案经天津医院医学伦理委员会批准（2024医伦局预019）；实验动物使用许可证号：SYXK（津）2023-011
作者贡献声明 柳鑫：研究设计、数据分析及论文撰写；石博文：动物模型制作及数据收集；蔡成阔，王昊天：数据收集整理及统计分析；贾鹏：研究设计及论文指导
骨质疏松症是一种常见的全身性骨骼疾病，其特点是骨矿物质密度低和骨质微结构退化，从而降低了骨强度，脆性骨折风险增加[1]，目前临床尚缺少安全、有效的治疗手段。骨量是通过成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的持续骨重塑来控制，如两者之间平衡打破，骨形成速度低于骨吸收，就会导致骨质疏松症。BMSCs由祖细胞和多能骨骼干细胞组成，可在体外分化为成骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞[2]。目前，研究表明几乎所有成骨细胞都来源于BMSCs[3]，由于BMSCs可分化成骨骼细胞表型，因此被认为是最理想的骨代谢研究对象[4]。
脊椎蛋白（R-spondin，Rspo）家族由4种分泌型糖蛋白（Rspo1～4）组成[5]，与发育和癌症等许多疾病病理性改变密切相关[6-7]。研究显示小鼠体内缺失Rspo受体LGR4会导致骨形成减少和骨吸收增加，发生骨质丢失，表明Rspo表达对维持骨代谢稳态至关重要[8]。Rspo2基因敲除小鼠表现出面部骨骼缺陷、远端肢体缺失和肺发育不全[9]。此外，骨关节炎患者体内的Rspo2 mRNA和蛋白表达量均减少，Rspo2表达下调会抑制体内成骨细胞矿化，且重组Rspo2则能提高此类患者成骨细胞矿化度[10]。然而，Rspo2对BMSCs诱导骨形成和分化的影响尚不清楚，为此本次研究旨在探究Rspo2在体外和体内对BMSCs向成骨分化的影响和其具体作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
雌性C57BL/6小鼠25只，其中10周龄小鼠18只，体质量21～24 g；4周龄小鼠7只，体质量12～14 g；均由华阜康生物科技股份有限公司提供。实验前适应性喂养1周，分笼饲养，每笼最多5只，自由饮食、饮水，光照时间12 h/d，温度25℃。
α-MEM培养基、FBS、青霉素溶液、硫酸链霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA 溶液（GIBCO公司，美国）；Rspo2重组蛋白（R&D公司，美国）；HE染色液（Sigma-Aldrich公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；江苏凯基生物技术股份有限公司）；抗Runx2抗体（Abcam公司，美国）；抗CD29、CD105、CD34、CD45流式抗体（BioLegend公司，美国）；FACS缓冲液（BD Biosciences公司，美国）；ALP染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol试剂（Life Technologies公司，美国）； PrimeScript RT逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa公司，日本）；羊抗鼠IgG2b-HRP二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司）；DAB显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；ELISA 检测试剂盒（武汉赛培生物科技有限公司）。
超速离心机（Beckman公司，美国）；酶标仪（Omega公司，德国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；流式细胞仪（BD公司，美国）；Micro-CT（Scanco Medical公司，瑞士）；Image-Pro Plus软件（Media Cybernetics公司，美国）；GraphPad Prism软件（GraphPad Software公司，美国）。
1.2 体外实验
1.2.1 BMSCs分离培养及鉴定
取7只4周龄小鼠，过量麻醉处死后置于75%乙醇5 min；分离股骨及胫骨，剪开长骨两端，以适量α-MEM培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液；以离心半径13 cm、
取对数生长期第3代细胞行细胞表型鉴定，流式细胞学检测示细胞表型标志物CD29、CD105阳性表达，表达率分别为96.38%、97.81%；CD34、CD45阴性表达，表达率分别为1.26%、0.82%。分离培养细胞符合MSCs表达特性，取第3代细胞用于下一步实验。
1.2.2 Rspo2对BMSCs活性的影响
取BMSCs以1×104个/孔密度接种于96孔板，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24 h后，分别加入浓度为10、20、40、80和100 nmol/L的Rspo2共培养24 h；每个浓度取6孔细胞，采用CCK-8法观测增殖情况，记录450 nm处吸光度（A）值，取均值。观察不同浓度Rspo2处理后BMSCs增殖差异，筛选不影响细胞活性浓度的Rspo2进行后续实验。并选取24 h细胞活性最强的浓度组连续培养24、48、72 h，观察Rspo2对BMSCs增殖影响。
1.2.3 Rspo2对BMSCs成骨能力的影响
将BMSCs以1×106个/孔接种于12孔板，孔板中分别滴加筛选的不同浓度Rspo2以及含15%FBS的α-MEM培养基；于37℃、5%CO2 孵箱中培养5 d后，加入25 μg/mL维生素C和5 mmol/L β-甘油磷酸以诱导成骨分化；诱导培养7 d后，取细胞进行ALP染色及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。以正常培养BMSCs作为对照。
① ALP染色：将细胞固定于10%甲醛15 min，PBS清洗3遍后加入ALP染色液，室温下孵育30 min后移除染色液，光镜下观察呈蓝紫色的阳性细胞，采用Image-Pro Plus软件测量ALP阳性细胞面积。实验重复3次。
② RT-qPCR检测：取细胞采用TRIzol试剂分离总RNA后，以PrimeScript RT逆转录试剂盒转化为cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行RCR扩增。热循环条件：95℃初始变性30 s，95℃ 5 s、60℃ 20 s、72℃ 15 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2–ΔΔCt方法计算成骨相关基因RUNX家族转录因子2（RUNX family transcription factor 2，Runx2）、Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ alpha 1，Col1）、骨钙素（osteocalcin，OCN）相对表达量。实验重复3次。引物序列见表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5’ →3’）
Table1.
Primer sequences of genes in qRT-PCR（5’ →3’）
1.3 动物实验
1.3.1 动物模型制备及分组
取18只10周龄小鼠随机分为3组：假手术组、卵巢去势（ovariectomy，OVX）组和OVX+Rspo2组，每组6只。腹腔注射10%水合氯醛（0.04 mL/10 g）麻醉后，假手术组仅行双侧背部切开缝合，其余两组通过双侧OVX建立骨质疏松模型。术后OVX+Rspo2组每周腹腔注射Rspo2（1 mg/kg）[11]，假手术组和OVX组接受相同剂量生理盐水。干预12周后，3组采用心脏取血方法获得全血，处死后取胫骨、子宫进行观测。
1.3.2 观测指标
① 一般情况：观察术后各组小鼠存活情况，称重小鼠体质量及子宫质量，评估OVX模型制备是否成功。
② 组织学及免疫组织化学染色： 将部分小鼠胫骨按顺序分别置于4%多聚甲醛4℃固定24 h、15%乙二胺四乙酸（pH7.2）脱钙14 d后，石蜡包埋、切片（片厚2～5 μm）。取部分切片行常规HE染色，光镜下观察骨小梁数量、排列疏松度及连接性。剩余切片脱蜡水化后PBS洗涤，3%H2O2中孵育30 min以抑制内源性过氧化物酶活性，然后应用Runx2一抗（1∶200）4℃孵育过夜，PBS洗涤后应用羊抗鼠IgG2b-HRP二抗室温下孵育1 h，DAB显色；光镜下观察阳性染色细胞，Image-Pro Plus软件对Runx2阳性细胞进行定量分析。
③ ELISA检测：将小鼠全血以离心半径13cm、1 200 r/min离心10 min，取血清按ELISA检测试剂盒标准操作步骤，检测小鼠血清骨代谢标记物ALP、OCN、Ⅰ型前胶原氨基端肽（type Ⅰ procollagen amino-terminal peptide，PINP）以及骨吸收标记物β胶原降解产物（β-isomerized C-telopeptide，β-CTX）含量。
④ Micro-CT 检测：将剩余小鼠胫骨置于4%多聚甲醛固定过夜后行Micro-CT扫描分析。扫描参数：电压89 kV、电流112 μA、厚度20 μm。采用自带SCANCO Evaluation软件对胫骨截面图像行三维组织形态计量分析，包括骨小梁厚度（trabeculae thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabeculae number，Tb.N）、骨小梁分离度（trabeculae separation，Tb.Sp）和骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 体外实验
2.1.1 Rspo2对BMSCs活性的影响
CCK-8检测示，培养24 h后10、20、40、80 nmol/L Rspo2组A值与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；仅100 nmol/L Rspo2组A值低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。随培养时间延长，20 nmol/L Rspo2组A值逐渐升高，其中72 h时A值明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。基于上述结果，选择10、20和40 nmol/L Rspo2进行后续实验。
图1
CCK-8检测Rspo2对BMSCs活性影响
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2.1.2 Rspo2对BMSCs成骨能力的影响
① ALP染色：成骨诱导培养7 d后，镜下观察阳性细胞的细胞膜和细胞质内均可见大量散在、深染的蓝紫色颗粒，叠加成结节状。各浓度Rspo2组阳性细胞面积明显大于对照组，其中20 nm/L Rspo2组最高，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图2a、b。
图2
Rspo2对BMSCs成骨分化的影响
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② RT-qPCR检测：各浓度Rspo2组中成骨相关基因相对表达量均高于对照组。其中，10、20 nmol/L Rspo2组Runx2、Col1和OCN以及40 nmol/L Rspo2组Col1和OCN与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2c。
2.2 动物实验
2.2.1 一般情况
各组小鼠术后均存活至实验完成。干预12周后，OVX组、OVX+Rspo2组小鼠体质量均较假手术组增加，但OVX+Rspo2组低于OVX组，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。OVX组、OVX+Rspo2组子宫质量低于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）；OVX+Rspo2组较OVX组有所增加，但组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。上述结果提示小鼠OVX模型制备成功。
图3
小鼠体质量及子宫质量比较
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2.2.2 组织学及免疫组织化学染色
HE染色示，与假手术组相比，OVX组小鼠骨小梁排列疏松、骨小梁宽度增加、数量减少且小梁间连接性差，而OVX+Rspo2组这一现象明显改善。见图4a。
图4
小鼠胫骨组织学及免疫组织化学染色观察（×20）
从左至右分别为假手术组、OVX组、OVX+Rspo2组 a. HE染色；b. Runx2免疫组织化学染色
Figure4. Histological and immunohistochemical staining of mice tibia (×20)From left to right for sham group, OVX group, and OVX+Rspo2 group, respectively a. HE staining; b. Runx2 immunohistochemical staining
免疫组织化学染色示，假手术组、OVX组以及OVX+Rspo2组Runx2表达分别为62.98±5.73、23.83±6.65、38.52±6.05。与假手术组相比OVX组表达降低，而OVX+Rspo2组经Rspo2干预后表达较OVX组增加，但尚未达假手术组水平，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4b。
2.2.3 ELISA检测
① 骨代谢标记物：与假手术组相比，OVX组ALP表达升高、PINP表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）；OCN组间差异无统计学意义（P>0.05）。OVX+Rspo2组经Rspo2干预后，PINP表达得到逆转，且ALP、OCN表达亦维持在较高水平，均高于假手术组及OVX组，差异有统计学意义（P<0.05）。② 骨吸收标记物： OVX组β-CTX高于假手术组；OVX+Rspo2组较OVX组明显下降，但尚未达假手术组水平；组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
ELISA检测血清骨代谢及骨吸收标记物表达
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2.2.4 Micro-CT 检测
与假手术组相比，OVX组Tb.Th、Tb.N和BV/TV降低，而Tb.Sp增高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与OVX组相比，OVX+Rspo2组BV/TV、Tb.N增高、Tb.Sp降低，差异有统计学意义（P<0.05）；Tb.Th组间差异无统计学意义（P>0.05）。OVX+Rspo2组BV/TV、Tb.Th仍低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）；Tb.N和Tb.Sp与假手术组差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。
图6
小鼠胫骨Micro-CT检测
a. 胫骨三维重建图 从左至右分别为假手术组、OVX组、OVX+Rspo2组； b. 骨参数定量分析 *
a. Three-dimensional reconstruction of tibia From left to right for sham group, OVX group, and OVX+Rspo2 group, respectively; b. Quantitative analysis of bone parameters *
3 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的疾病，其特征是骨密度和骨量下降，正在引起严重社会问题[12]。骨质疏松症的主要病因尚不清楚，包括内分泌、营养和遗传因素在内的各种病因都会导致骨质疏松[13]。其临床治疗主要包括抗骨吸收和促骨形成药物，尽管这些药物可以延缓骨质疏松症的发展，但双磷酸盐和特立帕肽在治疗后会损害骨重塑并导致骨坏死[14-15]。在本研究中，我们使用OVX小鼠模型来模拟绝经后骨质疏松症。OVX小鼠骨密度下降主要归因于破骨细胞寿命延长和破骨细胞增加[16]，雌激素水平降低将导致成骨细胞数量和活性降低。使用通过增加成骨细胞增殖或诱导成骨细胞分化和减少破骨细胞数量发挥作用的药物，可以增强骨形成并减骨质疏松症。本研究结果显示，OVX小鼠胫骨区域内骨小梁大片融合，骨小梁稀疏度增加小梁间连接性差，取而代之出现巨大空腔，而Rspo2干预后显著改善了OVX小鼠胫骨骨小梁微结构，骨小梁的密度及小梁间连接性显著改善。这表明Rspo2在OVX诱导的骨丢失过程中对成骨调节起到积极作用。
Rspos是一组由4种相关分泌蛋白组成的蛋白质，在器官发育、成体干细胞存活以及癌症发展中起着关键作用[17]。它们最初被分离为含有血小板反应蛋白结构域的基因，在神经元管的顶板中高表达，因此被称为“反应蛋白”。小鼠Rspo2基因敲除会导致胚胎死亡，这是因为肺和四肢发育存在重大缺陷[18]。一项研究表明，Rspo2通过促进破骨细胞生成来加速骨溶解[19]。骨形成和骨吸收是骨重建过程中发生的两种主要活动，尽管骨吸收的减少可以减缓骨质疏松症的发展，但骨量并不能显著有效地增加来抵抗骨质疏松症导致的病理性骨折频发。因此，在本研究中，我们探讨了Rspo2对体外BMSCs成骨分化和OVX诱导的体内骨丢失的影响。ALP是一种细胞膜相关酶，在矿物沉积的早期提供高浓度的磷酸盐，ALP活性与矿化开始前成骨细胞中细胞外基质的形成相关，并被公认为成骨细胞分化的标志[20]。本研究结果表面，Rspo2干预能显著增加BMSCs成骨分化过程中ALP的表达量，且二者表达在一定程度上呈现正相关趋势，说明Rspo2可能在成骨分化过程中有重要作用。
成骨细胞的分化过程通常分为间充质祖细胞、前成骨细胞和成骨细胞阶段。成骨细胞通常以OCN表达为特征，而成骨前细胞通常被认为表达转录因子Runx2，或者在更晚期的分化阶段同时表达Runx2和锌指蛋白，后者是包括OCN和ALP在内的关键成骨蛋白的主要转录因子[21]。成骨分化是一个复杂过程，导致矿化细胞外基质的形成。大量调节因子参与成骨分化。Runx2是成骨细胞分化的重要转录因子，与关键成骨细胞特异性基因的启动子区域直接相互作用[22]。有研究显示Runx2可能是更年期妇女骨代谢的有用遗传标记，并可能在骨密度中发挥重要作用[23]。OCN是一种编码骨钙素的基因，在骨骼形成和骨质疏松等骨代谢过程中起重要作用[24]。Col1是骨细胞外基质的重要成分，它将细胞表面整合素与其他细胞外基质蛋白连接起来，作为成骨细胞产生的分泌糖蛋白[25]。本研究发现BMSCs成骨分化过程中，Rspo2处理后成骨细胞标记基因Runx2、OCN、ALP和Col1表达量显著提升，说明Rspo2在祖细胞成骨分化中起到重要作用。但骨形成是一个复杂且连续过程，诸多基因及生物因子交互作用，本研究只是明确了Rspo2能够促进祖细胞的成骨分化，但具体作用机制仍需后续研究明确。
综上述，Rspo2通过在组织和细胞水平上调Runx2、ALP和OCN来促进成骨，从而促进BMSCs向成骨细胞谱系分化，进一步支持了Rspo2作为一种潜在的骨质疏松治疗策略的实用性。在未来研究中，我们将进行药代动力学、毒理学分析及随机对照研究，验证Rspo2对于刺激绝经后妇女骨形成以及伴随症状功效，探讨其潜在作用机制。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经研究方案经天津医院医学伦理委员会批准（2024医伦局预019）；实验动物使用许可证号：SYXK（津）2023-011
作者贡献声明 柳鑫：研究设计、数据分析及论文撰写；石博文：动物模型制作及数据收集；蔡成阔，王昊天：数据收集整理及统计分析；贾鹏：研究设计及论文指导
