引用本文： 张明浩, 贺唯, 于素香, 邸运涛, 李晓明. 壳聚糖水凝胶/聚丙烯网片复合材料修复大鼠腹壁缺损的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(10): 1261-1268. doi: 10.7507/1002-1892.202404042 复制
外伤、疝气、肿瘤等都会导致腹壁缺损，腹壁缺损修复一直是外科手术中的难题之一[1]。使用外科手术网片进行腹壁缺损修复是恢复肌肉筋膜层完整性的临床常规方法；然而，传统聚合物编织网片的粗糙表面容易摩擦内脏组织，导致与腹腔脏器粘连[2-4]，并且因粘连、网片收缩引起的疼痛和细菌感染等并发症，可导致愈合不良甚至复发[5-7]。为了解决这些问题，研究者们探索了多种方法以最大限度减小手术网片修复腹壁的副作用，其中在网片外包裹一层水凝胶是一种有效方法[8-10]。水凝胶在防止细胞黏附同时促进组织愈合方面表现出优异性能[11-14]。水凝胶不仅在腹壁修复时形成一层固态屏障，还可保证水分和氧气的透过性，具有类似细胞外基质的结构，可以支持细胞向内生长，其表面的高度亲水性减少了细胞黏附位点，不利于成纤维细胞等在水凝胶表面黏附[15]，因而用于腹壁修复具有一定抗粘连效果。
壳聚糖（chitosan，CS）作为一种天然多糖，可以从各种海鲜废弃物中提取和分离，其生物医学应用已得到广泛研究[16-19]。CS具有良好的生物相容性、生物降解性以及抗菌性，是制作水凝胶的常用材料之一。CS的降解产物是氨基糖，可以完全被生物体吸收，且体内植入后炎症反应和毒性小。CS水凝胶在组织工程领域已有广泛应用，而在腹壁修复领域其具有广阔应用前景，有望在抗粘连和伤口愈合方面提供新的策略[20-21]。
本研究通过物理交联方式制备CS水凝胶，并将其与临床上广泛使用的聚丙烯（polypropylene，PP）网片复合，制备了CS水凝胶/PP网片复合材料（以下简称“复合材料”）。本研究在材料表征的基础上，通过体外和体内生物学实验评价复合材料的生物相容性和修复效果，探讨CS水凝胶抗粘连和促进伤口愈合的积极作用，为其进一步临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
8～10周龄SD雄性大鼠18只，体质量200～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。于温度20℃、相对湿度50%±5%环境下合笼饲养，每笼3～4只大鼠，饲养期间大鼠自由进食、水并及时更换饲养垫料，保持笼内卫生环境，从购买至手术前保证4～7 d适应期。
CS（脱乙酰度≥95%）、碳酸钠（≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PP网片 ［强生（上海）医疗器材有限公司］；冰乙酸（≥99.5%，天津市致远化学试剂有限公司）；小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3；北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs；北京大学人民医院）；Matrigel基质胶（Corning公司，美国）；4%组织细胞固定液、抗荧光衰减封片（含DAPI）、改良HE染色试剂盒、改良Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。
Nikon Eclipse E100光学显微镜、LV100ND正置金相显微镜 ［尼康仪器（上海）有限公司）］；JSM-5600LV扫描电镜（JEOL公司，日本）；JC2000FM接触角测量仪（上海中晨数字技术设备有限公司）；FREEZONE 12冷冻干燥机（LABCONCO公司，美国）；LSM800荧光显微镜（Zeiss公司，德国）； AE20荧光倒置显微镜（南京瞭望光电技术有限公司）。
1.2 材料制备和表征
用乙酸溶液将CS溶液（4wt%）的pH值调节至5.5～5.8，然后加入饱和碳酸钠溶液，直至pH值达6.5～7.0；搅拌15 min后，将CS溶液静置，直至形成CS水凝胶。
将PP网片切割成大小为20 mm×15 mm的矩形块，并置于直径6 cm培养皿中。将制备的pH 6.5～7.0并搅拌好的CS溶液缓慢倒入培养皿中，确保溶液均匀分布于PP网片周围。然后室温保持24 h，制得复合材料。
大体观察复合材料外观，并于正置金相显微镜下分别观察PP网片和复合材料的微观结构；使用扫描电镜分别对冷冻干燥处理的CS水凝胶以及复合材料的孔隙微观形貌进行表征，并通过接触角测量仪分别测量CS水凝胶和PP网片的表面接触角来检测材料的亲水性。
1.3 体外细胞培养实验
① 成纤维细胞浸润实验：将灭菌后的复合材料（5 mm×5 mm）和300 μL NIH-3T3细胞悬液（浓度1×105个/mL）加入48孔板中（实验组），以单纯NIH-3T3细胞作为对照组。于37℃、5%CO2条件下培养1、3 d，分别取出行DAPI染色，荧光显微镜观察细胞阳性染色情况。
② HUVECs管形成实验：将复合材料（5 mm×5 mm）置于预涂有Matrigel基质胶的48孔板中，将1×105个/mL HUVECs接种至样品上（实验组），以单纯HUVECs作为对照组，于37℃、5%CO2条件下培养6 h，光镜观察细胞形态，以探索复合材料的血管生成潜力。
1.4 大鼠腹壁缺损修复实验
取18只SD大鼠，用0.3%戊巴比妥溶液（40～45 mg/kg）腹膜内注射麻醉。沿中线切开腹部皮肤，于腹部左、右两侧切除腹壁肌肉，以创建1.5 cm×1.0 cm的双侧全厚腹壁缺损。每只大鼠腹壁缺损区一侧植入复合材料（实验组），另一侧植入PP网片（对照组），将材料牢固缝合至附近腹部肌肉上，用缝线缝合腹部皮肤。于1、2、4周分别处死6只大鼠，取材进行以下观测：① 大体观察腹壁和腹腔内组织之间粘连及缺损伤口愈合情况。② 组织学观察：将材料置入4%组织细胞固定液中，石蜡包埋固定，切片，片厚4～5 μm。常规行HE染色观察组织结构和细胞形态学特征；每组随机选10个视野，使用Image J软件定量分析材料和腹壁接触部位处的细胞密度，以检测植入部位细胞浸润程度。同时常规行Masson染色观察组织中胶原纤维的分布、密度和结构变化；每组随机选10个视野，使用Image J软件对胶原含量进行定量分析，即阳性染色面积占整体面积的百分比。③ 免疫组织化学染色：术后2、4周取上述部分切片，常规行CD31（血管生成标志物）和CD68（巨噬细胞浸润标志物）免疫组织化学染色，观察阳性染色情况；每组随机选10个视野，使用Image J软件定量分析阳性细胞密度。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料经Sharpiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间及组内两个时间点间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 材料的表征
大体观察示，复合材料中的水凝胶薄膜呈浅黄色透明固态，厚度2～3 mm，PP网片被包裹在水凝胶内部，不易剥离。正置金相显微镜观察示，PP网片具有编织形成的网络结构；而复合材料中的水凝胶包裹着PP网片，且二者结合紧密。扫描电镜观察示，CS水凝胶具有大小不一的连通孔隙，孔径100～300 μm；复合材料中的PP网片在水凝胶中牢固包裹，水凝胶穿透PP网片，形成多孔结构。接触角测量示，CS水凝胶表面接触角为（39.2±0.3）°，且水滴滴加于水凝胶表面后数秒内铺展、消失，说明其具有强烈的吸水性和亲水性；而PP网片表面接触角为（125.9±0.4）°，且水滴滴加于材料表面后可维持较长时间，说明其表面高度疏水。见图1。
图1
CS水凝胶、PP网片及复合材料的表征
a. 复合材料大体形貌；b. PP网片（左）和复合材料（右）微观结构（正置金相显微镜×2）；c. 扫描电镜观察CS水凝胶（左，×100）和复合材料（右，×200）横截面微观形貌；d. CS水凝胶（左）和PP网片（右）表面接触角检测
Figure1. Characterization of CS hydrogel, PP mesh, and compositea. Macroscopic morphology of the composite; b. Microscopic structure of PP mesh (left) and composites (right) (Upright metallographic microscope×2); c. Cross-sectional microscopic morphology of CS hydrogel (left, ×100) and composite (right, ×200) observed by scanning electron microscopy; d. Contact angle measurement of CS hydrogel (left) and PP mesh (right)
2.2 体外细胞培养实验
DAPI染色示，培养1 d，实验组阳性细胞数量较少，而对照组阳性细胞长满整个孔板底部。培养3 d，实验组可见层次不一的荧光，与水凝胶表面接触的细胞呈球形，而对照组中细胞则呈梭形。见图2。
图2
复合材料成纤维细胞浸润实验（荧光显微镜×50）
从左至右依次为培养1、3 d a. 实验组；b. 对照组
Figure2. Fibroblast infiltration experiment of composites (Fluorescence microscopy×50)From left to right for 1 and 3 days after culture, respectively a. Experimental group; b. Control group
HUVECs管形成实验结果示，实验组HUVECs数量增多，且迁移聚拢，有形成管的趋势；而对照组细胞呈稀疏排布，无迁移趋势。见图3。
图3
复合材料HUVECs管形成实验（×100）
a. 对照组；b. 实验组
Figure3. HUVECs tube formation experiments of composites (×100)a. Control group; b. Experimental group
2.3 大鼠腹壁缺损修复实验
2.3.1 大体观察
术后1周，对照组无组织长入，部分黏膜覆盖；实验组已有组织和血管长入，开始再生。术后2周，对照组腹壁与脂肪组织粘连，无法分离；实验组无粘连，缺损处有大量新生组织和微血管。术后4周，对照组伤口部分愈合，新生组织向缺损内部生长，腹壁未完全恢复；实验组腹壁完整性恢复，组织无粘连，肌肉和血管再生，腹壁解剖结构基本重建。见图4。
图4
大鼠腹壁缺损修复大体观察
a. 对照组（从左至右依次为术后1、2、4周）；b. 实验组（从左至右依次为术后1、2、4周）；c. 术后2周腹壁内侧（红箭头示实验组，黑箭头示对照组）
Figure4. Macroscopic observation of rat abdominal wall defect repaira. Control group (From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively); b. Experimental group (From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively); c. Inner abdominal wall at postoperative 2 weeks (red arrow indicated experimental group, black arrow indicated control group)
2.3.2 HE染色观察
术后1周，两组均有大量细胞浸润，炎症反应均较明显，且有纤维囊包覆。术后2、4周，两组纤维囊仍存在，细胞浸润减少，可见新生血管形成及新生的腹壁肌肉细胞，炎症反应减少；对照组细胞均在内部，实验组细胞在内部浸润较弱，集中在水凝胶和肌肉组织之间。见图5a。
图5
两组大鼠体内植入材料各时间点HE染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）HE染色（×5） 黑色虚线示PP网片区域，红色虚线示未降解的水凝胶 从左至右依次为术后1、2、4周；b. 两组材料和腹壁接触部位处细胞密度比较
Figure5. HE staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. HE staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) The black dashed line indicated the PP mesh area, and the red dashed line indicated the undegraded hydrogel From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively; b. Comparison of cell density at the interface between the materials and the abdominal wall in both groups
定量分析示，随时间延长，两组材料和腹壁接触部位处细胞密度均有所下降，对照组下降趋势大于实验组。除术后1周两组细胞密度比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后2、4周实验组细胞密度均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5b。
2.3.3 Masson染色观察
术后1周，两组植入部位周围纤维化明显，产生大量胶原纤维，胶原排布均不具有取向性，随机度、混乱度大；术后2周，对照组胶原取向性不明显，4周时有一定取向性，但PP网片中间被松散的结缔组织所填充；术后2、4周，实验组胶原纤维排布整齐，有较大的定向排列度。定量分析示，术后2周，实验组胶原含量显著大于对照组（P<0.05）；术后1、4周，两组植入部位的胶原含量接近，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。
图6
两组大鼠体内植入材料各时间点Masson染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）Masson染色（×5） 黑色虚线示PP网片区域，红色虚线示未降解的水凝胶 从左至右依次为术后1、2、4周；b. 两组胶原含量比较
Figure6. Masson staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. Masson staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) The black dashed line indicated the PP mesh area, and the red dashed line indicated the undegraded hydrogel From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively; b. Comparison of collagen content between the two groups
2.3.4 免疫组织化学染色观察
术后2周，对照组仍存在较大缺损，CD31阳性细胞集中于缺损处；实验组CD31阳性细胞分布于新生肌肉层之间，腹壁缺损处的细胞已初步完成增殖重建过程。术后4周，两组CD31阳性细胞不再集中分布，部分阳性细胞出现在肌肉层之间和腹壁内表面。定量分析示，术后4周两组CD31阳性细胞比较术后2周明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；术后2周实验组CD31阳性细胞比显著高于对照组（P<0.05）。见图7。
图7
两组大鼠体内植入材料各时间点CD31免疫组织化学染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）CD31免疫组织化学染色（×5） 从左至右依次为术后2、4周；b. 两组CD31阳性细胞比比较
Figure7. CD31 immunohistochemical staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. CD31 immunohistochemical staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) From left to right for postoperative 2 and 4 weeks, respectively; b. Comparison of CD31-positive cell ratios between the two groups
术后2周，两组均可观察到大量炎症细胞，CD68阳性细胞密集聚集于腹壁缺损部位及材料与缺损部位接触处。术后4周，两组CD68阳性细胞集中于腹壁内膜和新生肌肉组织层之间。定量分析示，术后4周两组CD68阳性细胞比与术后2周相比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；术后2、4周实验组CD68阳性细胞比均显著低于对照组（P<0.05）。见图8。
图8
两组大鼠体内植入材料各时间点CD68免疫组织化学染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）CD68免疫组织化学染色（×5） 从左至右依次为术后2、4周；b. 两组CD68阳性细胞比比较
Figure8. CD68 immunohistochemical staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. CD68 immunohistochemical staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) From left to right for postoperative 2 and 4 weeks, respectively; b. Comparison of CD68-positive cell ratios between the two groups
3 讨论
3.1 CS水凝胶的凝胶化机制
在酸性条件下，CS通常呈可溶状态，而在中性或碱性环境中，CS链之间的静电相互作用增强，促进凝胶形成。具体而言，当CS溶液调至碱性时，其胺基带正电荷，导致CS链之间的静电排斥，从而形成凝胶，这一过程被称为“离子凝胶化”。本研究通过将PP网片浸入pH 6.5～7.0的CS溶液中，实现了PP网片的水凝胶包裹，成功制备了CS水凝胶/PP网片复合材料。大体和显微镜观察结果表明，CS水凝胶紧密包裹PP网片的微结构，有效防止水凝胶在植入后脱落，便于缝合于组织缺损处。
3.2 CS水凝胶的结构特性
扫描电镜观察示，CS水凝胶中的孔隙是由于冷冻干燥过程中水分挥发而形成的，这种多孔结构有助于细胞向水凝胶内部生长。虽然由于水凝胶较厚，PP网片的突起在表面不可见，但其侧面可见到PP纤维的延伸。部分裂纹是由于冷冻干燥过程中的收缩造成，但这并不影响其在体内的应用。PP网片的坚固结构确保了复合材料的稳定性，而水凝胶的多孔性能保持不变。
3.3 抗粘连和组织修复能力
将PP网片包裹在水凝胶内部解决了其过于疏水的问题，使其更适合组织修复，能有效吸收植入过程中的血液和组织液。DAPI染色结果示，亲水性水凝胶表面对细胞黏附有一定阻碍作用，这可能在体内发挥抗粘连的效果。此外，HUVECs管形成实验结果表明，CS水凝胶显著促进了内皮细胞的迁移和增殖，形成初步的血管网络，有助于组织修复。
在大鼠腹壁缺损修补实验中，复合材料组表现出优于仅使用PP网片组的愈合性能和组织再生能力。水凝胶适当地促进了组织生长，防止粘连并促进了腹壁结构恢复。研究表明，PP网片在植入后可能刺激周围组织，诱发粘连[22]，而CS水凝胶的复合减少了这种刺激，使腹部肌肉组织能够正常再生。此外，水凝胶在术后2、4周时均促进了缺损处伤口愈合。
3.4 细胞浸润与胶原沉积
HE染色结果示，水凝胶的植入刺激了细胞的招募，持续促进后续组织再生。胶原沉积方面，水凝胶的植入显著促进了胶原的有序排列，表明CS在伤口愈合过程中的重要调节作用。这种胶原纤维的定向排列对改善细胞外基质的构建至关重要[23-24]。
3.5 巨噬细胞的作用
在伤口修复过程中，巨噬细胞在组织重塑中起着重要作用[25-27]。CD68免疫组织化学染色示，植入后2周两组均有大量炎症细胞，CD68阳性细胞密集聚集在腹壁缺损和材料之间的接触区域，这可能归因于腹壁损伤后身体启动的伤口愈合过程。巨噬细胞的出现有助于清除凋亡细胞和杂质，并为血管生成做准备。有研究表明，巨噬细胞还可以将成纤维细胞和平滑肌细胞吸引到伤口部位，促进胶原基质沉积和伤口组织愈合[28-30]。4周后，复合材料组的CD68阳性细胞比例较低，表明炎症反应得到了更好的控制。
综上述，本研究制备的CS水凝胶/PP网片复合材料显示出良好的生物相容性和亲水性，提供了细胞生长的理想支架。通过体外和体内实验，验证了该复合材料在抗粘连和促进伤口愈合方面的能力，表明CS水凝胶在愈合过程中具有抗炎和促进血管生成的潜力，为腹壁修复提供了新的见解和策略。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经北京航空航天大学动物实验伦理审查委员会批准（BM201900117）；实验动物使用许可证批准号：SYXK（京）2019-0017
作者贡献声明 张明浩：制作腹壁缺损模型，数据收集；贺唯：修复材料的制备和基本表征，数据分析，文章撰写；于素香：制作组织切片与染色；邸运涛：指导动物体内植入实验；李晓明：整体实验设计和指导，观点补充及文章修改
外伤、疝气、肿瘤等都会导致腹壁缺损，腹壁缺损修复一直是外科手术中的难题之一[1]。使用外科手术网片进行腹壁缺损修复是恢复肌肉筋膜层完整性的临床常规方法；然而，传统聚合物编织网片的粗糙表面容易摩擦内脏组织，导致与腹腔脏器粘连[2-4]，并且因粘连、网片收缩引起的疼痛和细菌感染等并发症，可导致愈合不良甚至复发[5-7]。为了解决这些问题，研究者们探索了多种方法以最大限度减小手术网片修复腹壁的副作用，其中在网片外包裹一层水凝胶是一种有效方法[8-10]。水凝胶在防止细胞黏附同时促进组织愈合方面表现出优异性能[11-14]。水凝胶不仅在腹壁修复时形成一层固态屏障，还可保证水分和氧气的透过性，具有类似细胞外基质的结构，可以支持细胞向内生长，其表面的高度亲水性减少了细胞黏附位点，不利于成纤维细胞等在水凝胶表面黏附[15]，因而用于腹壁修复具有一定抗粘连效果。
壳聚糖（chitosan，CS）作为一种天然多糖，可以从各种海鲜废弃物中提取和分离，其生物医学应用已得到广泛研究[16-19]。CS具有良好的生物相容性、生物降解性以及抗菌性，是制作水凝胶的常用材料之一。CS的降解产物是氨基糖，可以完全被生物体吸收，且体内植入后炎症反应和毒性小。CS水凝胶在组织工程领域已有广泛应用，而在腹壁修复领域其具有广阔应用前景，有望在抗粘连和伤口愈合方面提供新的策略[20-21]。
本研究通过物理交联方式制备CS水凝胶，并将其与临床上广泛使用的聚丙烯（polypropylene，PP）网片复合，制备了CS水凝胶/PP网片复合材料（以下简称“复合材料”）。本研究在材料表征的基础上，通过体外和体内生物学实验评价复合材料的生物相容性和修复效果，探讨CS水凝胶抗粘连和促进伤口愈合的积极作用，为其进一步临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
8～10周龄SD雄性大鼠18只，体质量200～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。于温度20℃、相对湿度50%±5%环境下合笼饲养，每笼3～4只大鼠，饲养期间大鼠自由进食、水并及时更换饲养垫料，保持笼内卫生环境，从购买至手术前保证4～7 d适应期。
CS（脱乙酰度≥95%）、碳酸钠（≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PP网片 ［强生（上海）医疗器材有限公司］；冰乙酸（≥99.5%，天津市致远化学试剂有限公司）；小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3；北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs；北京大学人民医院）；Matrigel基质胶（Corning公司，美国）；4%组织细胞固定液、抗荧光衰减封片（含DAPI）、改良HE染色试剂盒、改良Masson三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。
Nikon Eclipse E100光学显微镜、LV100ND正置金相显微镜 ［尼康仪器（上海）有限公司）］；JSM-5600LV扫描电镜（JEOL公司，日本）；JC2000FM接触角测量仪（上海中晨数字技术设备有限公司）；FREEZONE 12冷冻干燥机（LABCONCO公司，美国）；LSM800荧光显微镜（Zeiss公司，德国）； AE20荧光倒置显微镜（南京瞭望光电技术有限公司）。
1.2 材料制备和表征
用乙酸溶液将CS溶液（4wt%）的pH值调节至5.5～5.8，然后加入饱和碳酸钠溶液，直至pH值达6.5～7.0；搅拌15 min后，将CS溶液静置，直至形成CS水凝胶。
将PP网片切割成大小为20 mm×15 mm的矩形块，并置于直径6 cm培养皿中。将制备的pH 6.5～7.0并搅拌好的CS溶液缓慢倒入培养皿中，确保溶液均匀分布于PP网片周围。然后室温保持24 h，制得复合材料。
大体观察复合材料外观，并于正置金相显微镜下分别观察PP网片和复合材料的微观结构；使用扫描电镜分别对冷冻干燥处理的CS水凝胶以及复合材料的孔隙微观形貌进行表征，并通过接触角测量仪分别测量CS水凝胶和PP网片的表面接触角来检测材料的亲水性。
1.3 体外细胞培养实验
① 成纤维细胞浸润实验：将灭菌后的复合材料（5 mm×5 mm）和300 μL NIH-3T3细胞悬液（浓度1×105个/mL）加入48孔板中（实验组），以单纯NIH-3T3细胞作为对照组。于37℃、5%CO2条件下培养1、3 d，分别取出行DAPI染色，荧光显微镜观察细胞阳性染色情况。
② HUVECs管形成实验：将复合材料（5 mm×5 mm）置于预涂有Matrigel基质胶的48孔板中，将1×105个/mL HUVECs接种至样品上（实验组），以单纯HUVECs作为对照组，于37℃、5%CO2条件下培养6 h，光镜观察细胞形态，以探索复合材料的血管生成潜力。
1.4 大鼠腹壁缺损修复实验
取18只SD大鼠，用0.3%戊巴比妥溶液（40～45 mg/kg）腹膜内注射麻醉。沿中线切开腹部皮肤，于腹部左、右两侧切除腹壁肌肉，以创建1.5 cm×1.0 cm的双侧全厚腹壁缺损。每只大鼠腹壁缺损区一侧植入复合材料（实验组），另一侧植入PP网片（对照组），将材料牢固缝合至附近腹部肌肉上，用缝线缝合腹部皮肤。于1、2、4周分别处死6只大鼠，取材进行以下观测：① 大体观察腹壁和腹腔内组织之间粘连及缺损伤口愈合情况。② 组织学观察：将材料置入4%组织细胞固定液中，石蜡包埋固定，切片，片厚4～5 μm。常规行HE染色观察组织结构和细胞形态学特征；每组随机选10个视野，使用Image J软件定量分析材料和腹壁接触部位处的细胞密度，以检测植入部位细胞浸润程度。同时常规行Masson染色观察组织中胶原纤维的分布、密度和结构变化；每组随机选10个视野，使用Image J软件对胶原含量进行定量分析，即阳性染色面积占整体面积的百分比。③ 免疫组织化学染色：术后2、4周取上述部分切片，常规行CD31（血管生成标志物）和CD68（巨噬细胞浸润标志物）免疫组织化学染色，观察阳性染色情况；每组随机选10个视野，使用Image J软件定量分析阳性细胞密度。
1.5 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料经Sharpiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，组间及组内两个时间点间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 材料的表征
大体观察示，复合材料中的水凝胶薄膜呈浅黄色透明固态，厚度2～3 mm，PP网片被包裹在水凝胶内部，不易剥离。正置金相显微镜观察示，PP网片具有编织形成的网络结构；而复合材料中的水凝胶包裹着PP网片，且二者结合紧密。扫描电镜观察示，CS水凝胶具有大小不一的连通孔隙，孔径100～300 μm；复合材料中的PP网片在水凝胶中牢固包裹，水凝胶穿透PP网片，形成多孔结构。接触角测量示，CS水凝胶表面接触角为（39.2±0.3）°，且水滴滴加于水凝胶表面后数秒内铺展、消失，说明其具有强烈的吸水性和亲水性；而PP网片表面接触角为（125.9±0.4）°，且水滴滴加于材料表面后可维持较长时间，说明其表面高度疏水。见图1。
图1
CS水凝胶、PP网片及复合材料的表征
a. 复合材料大体形貌；b. PP网片（左）和复合材料（右）微观结构（正置金相显微镜×2）；c. 扫描电镜观察CS水凝胶（左，×100）和复合材料（右，×200）横截面微观形貌；d. CS水凝胶（左）和PP网片（右）表面接触角检测
Figure1. Characterization of CS hydrogel, PP mesh, and compositea. Macroscopic morphology of the composite; b. Microscopic structure of PP mesh (left) and composites (right) (Upright metallographic microscope×2); c. Cross-sectional microscopic morphology of CS hydrogel (left, ×100) and composite (right, ×200) observed by scanning electron microscopy; d. Contact angle measurement of CS hydrogel (left) and PP mesh (right)
2.2 体外细胞培养实验
DAPI染色示，培养1 d，实验组阳性细胞数量较少，而对照组阳性细胞长满整个孔板底部。培养3 d，实验组可见层次不一的荧光，与水凝胶表面接触的细胞呈球形，而对照组中细胞则呈梭形。见图2。
图2
复合材料成纤维细胞浸润实验（荧光显微镜×50）
从左至右依次为培养1、3 d a. 实验组；b. 对照组
Figure2. Fibroblast infiltration experiment of composites (Fluorescence microscopy×50)From left to right for 1 and 3 days after culture, respectively a. Experimental group; b. Control group
HUVECs管形成实验结果示，实验组HUVECs数量增多，且迁移聚拢，有形成管的趋势；而对照组细胞呈稀疏排布，无迁移趋势。见图3。
图3
复合材料HUVECs管形成实验（×100）
a. 对照组；b. 实验组
Figure3. HUVECs tube formation experiments of composites (×100)a. Control group; b. Experimental group
2.3 大鼠腹壁缺损修复实验
2.3.1 大体观察
术后1周，对照组无组织长入，部分黏膜覆盖；实验组已有组织和血管长入，开始再生。术后2周，对照组腹壁与脂肪组织粘连，无法分离；实验组无粘连，缺损处有大量新生组织和微血管。术后4周，对照组伤口部分愈合，新生组织向缺损内部生长，腹壁未完全恢复；实验组腹壁完整性恢复，组织无粘连，肌肉和血管再生，腹壁解剖结构基本重建。见图4。
图4
大鼠腹壁缺损修复大体观察
a. 对照组（从左至右依次为术后1、2、4周）；b. 实验组（从左至右依次为术后1、2、4周）；c. 术后2周腹壁内侧（红箭头示实验组，黑箭头示对照组）
Figure4. Macroscopic observation of rat abdominal wall defect repaira. Control group (From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively); b. Experimental group (From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively); c. Inner abdominal wall at postoperative 2 weeks (red arrow indicated experimental group, black arrow indicated control group)
2.3.2 HE染色观察
术后1周，两组均有大量细胞浸润，炎症反应均较明显，且有纤维囊包覆。术后2、4周，两组纤维囊仍存在，细胞浸润减少，可见新生血管形成及新生的腹壁肌肉细胞，炎症反应减少；对照组细胞均在内部，实验组细胞在内部浸润较弱，集中在水凝胶和肌肉组织之间。见图5a。
图5
两组大鼠体内植入材料各时间点HE染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）HE染色（×5） 黑色虚线示PP网片区域，红色虚线示未降解的水凝胶 从左至右依次为术后1、2、4周；b. 两组材料和腹壁接触部位处细胞密度比较
Figure5. HE staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. HE staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) The black dashed line indicated the PP mesh area, and the red dashed line indicated the undegraded hydrogel From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively; b. Comparison of cell density at the interface between the materials and the abdominal wall in both groups
定量分析示，随时间延长，两组材料和腹壁接触部位处细胞密度均有所下降，对照组下降趋势大于实验组。除术后1周两组细胞密度比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后2、4周实验组细胞密度均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5b。
2.3.3 Masson染色观察
术后1周，两组植入部位周围纤维化明显，产生大量胶原纤维，胶原排布均不具有取向性，随机度、混乱度大；术后2周，对照组胶原取向性不明显，4周时有一定取向性，但PP网片中间被松散的结缔组织所填充；术后2、4周，实验组胶原纤维排布整齐，有较大的定向排列度。定量分析示，术后2周，实验组胶原含量显著大于对照组（P<0.05）；术后1、4周，两组植入部位的胶原含量接近，差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。
图6
两组大鼠体内植入材料各时间点Masson染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）Masson染色（×5） 黑色虚线示PP网片区域，红色虚线示未降解的水凝胶 从左至右依次为术后1、2、4周；b. 两组胶原含量比较
Figure6. Masson staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. Masson staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) The black dashed line indicated the PP mesh area, and the red dashed line indicated the undegraded hydrogel From left to right for postoperative 1, 2, and 4 weeks, respectively; b. Comparison of collagen content between the two groups
2.3.4 免疫组织化学染色观察
术后2周，对照组仍存在较大缺损，CD31阳性细胞集中于缺损处；实验组CD31阳性细胞分布于新生肌肉层之间，腹壁缺损处的细胞已初步完成增殖重建过程。术后4周，两组CD31阳性细胞不再集中分布，部分阳性细胞出现在肌肉层之间和腹壁内表面。定量分析示，术后4周两组CD31阳性细胞比较术后2周明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；术后2周实验组CD31阳性细胞比显著高于对照组（P<0.05）。见图7。
图7
两组大鼠体内植入材料各时间点CD31免疫组织化学染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）CD31免疫组织化学染色（×5） 从左至右依次为术后2、4周；b. 两组CD31阳性细胞比比较
Figure7. CD31 immunohistochemical staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. CD31 immunohistochemical staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) From left to right for postoperative 2 and 4 weeks, respectively; b. Comparison of CD31-positive cell ratios between the two groups
术后2周，两组均可观察到大量炎症细胞，CD68阳性细胞密集聚集于腹壁缺损部位及材料与缺损部位接触处。术后4周，两组CD68阳性细胞集中于腹壁内膜和新生肌肉组织层之间。定量分析示，术后4周两组CD68阳性细胞比与术后2周相比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；术后2、4周实验组CD68阳性细胞比均显著低于对照组（P<0.05）。见图8。
图8
两组大鼠体内植入材料各时间点CD68免疫组织化学染色观察
a. 对照组（上）和实验组（下）CD68免疫组织化学染色（×5） 从左至右依次为术后2、4周；b. 两组CD68阳性细胞比比较
Figure8. CD68 immunohistochemical staining observation of implanted materials in both groups of rats at different time pointsa. CD68 immunohistochemical staining of control group (top) and experimental group (bottom) (×5) From left to right for postoperative 2 and 4 weeks, respectively; b. Comparison of CD68-positive cell ratios between the two groups
3 讨论
3.1 CS水凝胶的凝胶化机制
在酸性条件下，CS通常呈可溶状态，而在中性或碱性环境中，CS链之间的静电相互作用增强，促进凝胶形成。具体而言，当CS溶液调至碱性时，其胺基带正电荷，导致CS链之间的静电排斥，从而形成凝胶，这一过程被称为“离子凝胶化”。本研究通过将PP网片浸入pH 6.5～7.0的CS溶液中，实现了PP网片的水凝胶包裹，成功制备了CS水凝胶/PP网片复合材料。大体和显微镜观察结果表明，CS水凝胶紧密包裹PP网片的微结构，有效防止水凝胶在植入后脱落，便于缝合于组织缺损处。
3.2 CS水凝胶的结构特性
扫描电镜观察示，CS水凝胶中的孔隙是由于冷冻干燥过程中水分挥发而形成的，这种多孔结构有助于细胞向水凝胶内部生长。虽然由于水凝胶较厚，PP网片的突起在表面不可见，但其侧面可见到PP纤维的延伸。部分裂纹是由于冷冻干燥过程中的收缩造成，但这并不影响其在体内的应用。PP网片的坚固结构确保了复合材料的稳定性，而水凝胶的多孔性能保持不变。
3.3 抗粘连和组织修复能力
将PP网片包裹在水凝胶内部解决了其过于疏水的问题，使其更适合组织修复，能有效吸收植入过程中的血液和组织液。DAPI染色结果示，亲水性水凝胶表面对细胞黏附有一定阻碍作用，这可能在体内发挥抗粘连的效果。此外，HUVECs管形成实验结果表明，CS水凝胶显著促进了内皮细胞的迁移和增殖，形成初步的血管网络，有助于组织修复。
在大鼠腹壁缺损修补实验中，复合材料组表现出优于仅使用PP网片组的愈合性能和组织再生能力。水凝胶适当地促进了组织生长，防止粘连并促进了腹壁结构恢复。研究表明，PP网片在植入后可能刺激周围组织，诱发粘连[22]，而CS水凝胶的复合减少了这种刺激，使腹部肌肉组织能够正常再生。此外，水凝胶在术后2、4周时均促进了缺损处伤口愈合。
3.4 细胞浸润与胶原沉积
HE染色结果示，水凝胶的植入刺激了细胞的招募，持续促进后续组织再生。胶原沉积方面，水凝胶的植入显著促进了胶原的有序排列，表明CS在伤口愈合过程中的重要调节作用。这种胶原纤维的定向排列对改善细胞外基质的构建至关重要[23-24]。
3.5 巨噬细胞的作用
在伤口修复过程中，巨噬细胞在组织重塑中起着重要作用[25-27]。CD68免疫组织化学染色示，植入后2周两组均有大量炎症细胞，CD68阳性细胞密集聚集在腹壁缺损和材料之间的接触区域，这可能归因于腹壁损伤后身体启动的伤口愈合过程。巨噬细胞的出现有助于清除凋亡细胞和杂质，并为血管生成做准备。有研究表明，巨噬细胞还可以将成纤维细胞和平滑肌细胞吸引到伤口部位，促进胶原基质沉积和伤口组织愈合[28-30]。4周后，复合材料组的CD68阳性细胞比例较低，表明炎症反应得到了更好的控制。
综上述，本研究制备的CS水凝胶/PP网片复合材料显示出良好的生物相容性和亲水性，提供了细胞生长的理想支架。通过体外和体内实验，验证了该复合材料在抗粘连和促进伤口愈合方面的能力，表明CS水凝胶在愈合过程中具有抗炎和促进血管生成的潜力，为腹壁修复提供了新的见解和策略。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经北京航空航天大学动物实验伦理审查委员会批准（BM201900117）；实验动物使用许可证批准号：SYXK（京）2019-0017
作者贡献声明 张明浩：制作腹壁缺损模型，数据收集；贺唯：修复材料的制备和基本表征，数据分析，文章撰写；于素香：制作组织切片与染色；邸运涛：指导动物体内植入实验；李晓明：整体实验设计和指导，观点补充及文章修改
