引用本文： 殷渠东, 毛栋, 芮永军. Masquelet技术诱导膜自发成骨原因实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(10): 1254-1260. doi: 10.7507/1002-1892.202403021 复制
Masquelet技术，又称诱导膜技术，是临床常用的一种骨缺损修复方法。但是，目前对于该技术促进骨愈合的作用机制尚未完全明确，主要有以下3种理论：① 诱导膜具有保护性物理屏障，防止自体骨吸收作用；② 诱导膜含丰富的细胞（包括MSCs）以及与骨形成相关的营养因子；③ 诱导膜含丰富血管网，可侵入骨缺损区，从而避免骨吸收和坏死[1-6]。后两种理论提示诱导膜具有成骨活性，而且相关研究发现聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥间隔填塞动物股骨缺损后，在靠近骨端的诱导膜膜内形成了少量唇状新骨[7-9]。本课题组前期动物实验中也观察到诱导膜内新骨形成现象，在临床采用Masquelet技术治疗的患者中亦发现一期骨水泥植入手术后出现不同程度成骨，甚至修复部分骨缺损现象[10]。我们将未植骨但在诱导膜膜内形成新骨的现象称为“诱导膜自发成骨”，利用该现象有可能在不植骨或少量植骨条件下通过Masquelet技术修复骨缺损。然而，目前缺少诱导膜自发成骨原因的研究，为此我们基于大鼠模型进行探讨，以期为该技术应用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
7～9周龄SPF级雄性SD大鼠42只，体质量225～280 g，平均253 g，由苏州佰盛生物技术有限公司提供。术前大鼠适应性饲养1周，温度20～23℃，昼夜光照循环时间1∶1，湿度60%～80%。
万古霉素（浙江医药股份有限公司新昌制药厂）；医用级聚甲基丙烯酸甲酯（商品名：CMW 3；DePuy公司，英国）；小鼠抗大鼠STRO-1单克隆抗体 ［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（武汉塞维尔生物科技有限公司）。
硅胶模具（上海黑焰医疗科技有限公司）；6孔小钢板（商品名：宠物ALPS纯钛合金锁定重建骨板；广州市华创医疗器械有限公司）；光学显微镜（Nikon公司，日本）；Image J软件（美国国立卫生院）；游标卡尺（安徽砀山县通和量具有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 骨水泥间隔制备
将万古霉素与医用级聚甲基丙烯酸甲酯固体粉剂以1∶20比例混匀，然后与液剂混合，待呈“胶状”后倒入硅胶模具中成型。根据预实验结果成年大鼠股骨中段直径平均4 mm，本研究制备长度10 mm、直径4 mm的空心圆柱状骨水泥间隔，环氧乙烷灭菌备用。
1.2.2 动物模型制备及分组
取42只大鼠制备右后肢股骨中段临界骨缺损模型[11-12]。腹腔注射5%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，右后肢剃毛备皮，从股骨大转子至股骨外髁纵向切开皮肤、筋膜，切口长度约2.5 cm；在肌间隙分离显露股骨，在骨膜外将股骨中段与周围肌肉分离后牵开。使用摇摆锯在股骨中段截骨，截骨长度10 mm，移除中间骨干和骨膜。
将大鼠股骨缺损模型随机分为4组，其中A～C组各12只、D组6 只。A、B组：将骨水泥间隔以直径1.4 mm克氏针贯穿固定于两截骨端髓腔内，其中A组截骨端不作处理，B组用负载万古霉素的骨水泥包裹骨水泥间隔与截骨端连接处、封闭截骨端髓腔；C组：将骨水泥间隔用缝线捆绑于6孔小钢板上，然后钢板固定两截骨端；D组：骨缺损旷置，仅以6孔小钢板固定两截骨端。冲洗切口，可吸收缝线逐层缝合肌肉、浅筋膜和皮肤。见图1。术后3 d内每天肌肉注射青霉素钠4×104 U以防止感染，单笼饲养至切口愈合后混笼饲养。
图1
各组模型制备
a. 股骨截骨；b～e. A～D组骨缺损处理；f～i. A～D组骨缺损处理后X线片
Figure1. Preparation of models in each groupa. Femoral osteotomy; b-e. Bone defect treatment in groups A-D, respectively; f-i. X-ray films after bone defect treatment in groups A-D, respectively
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
术后观察各组大鼠存活及术后肢体活动恢复情况。
1.3.2 诱导膜MSCs含量观测
采用STRO-1免疫组织化学染色评估诱导膜中MSCs含量。术后5周，A～C组各取6只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥（120 mg/kg）处死后，按照原切口入路取诱导膜。为避免切取时损伤截骨端骨膜，均统一取诱导膜中段6 mm长组织进行观测。
将诱导膜置于10%甲醛中固定24 h后取出，制备5 μm厚切片。按照常规操作处理后，滴加STRO-1抗体（1∶200），4℃避光过夜孵育；滴加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（1∶1 000），37℃孵育1 h；滴加DAB染色液，室温孵育10 min；苏木素染色液室温孵育30 s；脱水、透明、封片后光镜下观察，黄褐色染色细胞即为STRO-1阳性细胞。于400倍镜下每张切片选择3个视野，采用Image J软件行吸光度（A）值分析，记录阳性细胞所占百分比，作为MSCs含量，取均值。
1.3.3 诱导膜自发成骨观测
术后12周，取各组剩余大鼠同上法处死后进行以下观测。 ① X线片观察：摄正位X线片观察有无新骨形成，利用自带直尺测量新骨长度。② 大体观察：按照原切口入路显露股骨，取出内固定物和骨水泥间隔，观察诱导膜和成骨情况，并用游标卡尺测量诱导膜厚度。 ③ 组织学观察：取骨缺损段组织，其中未骨化组织经石蜡包埋、切片（厚3 μm）后常规HE染色；骨化组织按顺序置于4%多聚甲醛固定48 h、脱钙液浸泡1个月后，石蜡包埋、切片（厚度4 μm）后行番红O-固绿染色。光镜下观察组织构成。
1.4 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后4组大鼠均存活至实验完成。术后切口均顺利愈合，大鼠恢复后肢运动功能。但D组4只大鼠于术后8～12周出现内固定物松动或失效，患肢活动减少，未作特殊处理。
2.2 诱导膜MSCs含量观测
术后5周免疫组织化学染色示B组呈阴性，A、C组均可见STRO-1阳性细胞， MSCs含量分别14.20%±1.92%和5.00%±0.71%，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
图2
A～C组术后5周免疫组织化学染色观察
a. A组（×400）； b. B组（×40）；c. C组（×400）
Figure2. Immunohistochemical staining observation of groups A-C at 5 weeks after operationa. Group A (×400); b. Group B (×40); c. Group C (×400)
2.3 诱导膜自发成骨观测
2.3.1 X线片检查
A组：截骨端与骨水泥间隔之间的间隙消失，新骨自截骨端向骨缺损中央生长并超过骨缺损中线，形成唇状包裹骨水泥间隔，一侧新骨长度为2～7 mm，平均3.1 mm。B组：截骨端未见新骨形成。C组：截骨端与骨水泥间隔之间的间隙部分消失，少量新骨形成，一侧新骨长度为0～3 mm，平均0.7 mm。D组：截骨端未见新骨形成且有骨萎缩。见图3。
图3
A～D组术后12周X线片观察
a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure3. X-ray films of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.2 大体观察
A组：中段诱导膜厚度约1 mm，两端诱导膜质地较硬，均有不同程度唇状新骨沿诱导膜生长，其中骨缺损近端和切口深部侧形成的新骨较多。B组：诱导膜厚度均匀，约1 mm，质地较软，截骨端见骨萎缩。C组：诱导膜厚度约1 mm，靠近截骨端的诱导膜质地较硬、稍厚，并有少许新骨。D组：截骨端被软组织包裹，并发生骨吸收、骨萎缩，其中4只大鼠内固定物松动。见图4。
图4
A～D组术后12周大体观察
a. A组； b. B组； c. C组；d. D组
Figure4. Gross observation of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.3 组织学观察
4组中仅A、C组有新骨形成，取骨化组织行番红O-固绿染色，镜下见诱导膜中均含骨与软骨。HE染色示A～C组诱导膜中含少量新生血管和纤维组织；D组胶原纤维增生，可见较多成纤维细胞和少量新生血管。见图5。
图5
A～D组术后12周组织学观察（×200）
a、b. A、C组番红O-固绿染色； c～f. A～D组HE染色
Figure5. Histological observation of groups A-D at 12 weeks after operation (×200)a, b. Safranin O-green staining of groups A and C, respectively; c-f. HE staining of groups A-D, respectively
3 讨论
3.1 诱导膜作用
采用Masquelet技术修复骨缺损时形成的诱导膜具有以下作用：① 诱导膜和骨水泥间隔起到防止生长速度较快的软组织长入骨缺损部位作用。Klaue等[8]研究显示如果骨缺损处没有诱导膜和骨水泥间隔，纤维组织将向骨缺损处生长，骨端被纤维组织包裹，发生骨吸收和骨萎缩。本研究D组也观察到类似结果。② 诱导膜能分泌BMP-2、VEGF和TGF-β等成骨或成血管因子[13-18]，从而促进骨再生。③ 诱导膜和骨水泥间隔共同维持合适的膜下空间，在膜引导性骨再生和膜自发性成骨中发挥重要作用[10, 19]；同时，诱导膜起到吸引细胞和骨生长因子附着的生物支架作用，有利于血管长入和新骨形成。④ 诱导膜表面有丰富的微血管，可以增加骨移植部位的血运[2，11]。⑤ 诱导膜含骨形成细胞或骨祖细胞，主要是MSCs，可分化成成骨细胞[4，12-13]。
3.2 诱导膜自发成骨原因分析
对于影响骨缺损修复的关键要素，有学者提出了“钻石理论”，即骨缺损的成功修复需要骨诱导介质、骨形成细胞、骨传导基质（支架）、最佳机械环境、充足血运，以及解决宿主合并疾病，任何要素均不能缺乏[20]。
本研究大体观察见A组新骨形成最多，其次为C组，B组无自发成骨；而免疫组织化学染色结果亦提示A组诱导膜中MSCs含量最高，C组较少，B组诱导膜无MSCs，与大体观察成骨结果相对应。Mathieu等[4]、Henrich等[12]、Pélissier等[13]的研究发现只有位于骨缺损处的诱导膜才含MSCs，皮下形成的诱导膜不含MSCs。张浩等[21]的动物实验结果显示，与不堵塞组相比，髓腔堵塞组膜内形成新骨明显延迟且更少，提示膜引导性骨再生自发成骨的MSCs主要来自骨髓，该观点得到其他研究认同[19]。本研究A、B组均采用克氏针髓腔内固定，随着术后肢体活动，克氏针激发髓腔内骨髓溢出，故A组诱导膜中的MSCs多于钢板内固定的C组；而B组髓腔封闭，故没有骨髓溢出，诱导膜中则未见MSCs。所以A组有明显自发成骨现象，C组仅骨端少许新骨，B组没有新骨形成。本研究观测结果与上述研究一致，进一步明确截骨端骨髓溢出并提供MSCs，对诱导膜自发成骨起关键作用。
综上述，我们认为靠近截骨端的诱导膜具备上述“钻石理论”的关键要素，骨诱导介质、骨形成细胞（主要MSCs）、骨传导基质、较佳的机械环境（由内固定或外固定提供）和充足血运，所以可形成新骨（自发成骨）。
3.3 诱导膜自发成骨特点及影响因素
由于只有靠近截骨端才有骨髓中的MSCs溢出，诱导膜才有自发成骨现象，所以自发成骨呈现沿诱导膜自截骨端向骨缺损中央生长，在骨端形成明显唇状或尖齿状新骨，是其最明显特点。
诱导膜自发成骨另一特点是新骨形成呈现不均匀性，这与自发成骨影响因素有关，影响因素主要有溢出骨髓数量、诱导膜与骨缺损大小匹配度、诱导膜和截骨端的稳定性等。Wang等[11]研究显示截骨近端尤其是下方的诱导膜活性高于截骨远端和上方，因该部位残余骨髓和骨膜较多，所以在切口深部新骨较多；通常股骨近端位置较高，髓腔内骨髓容易溢出，所以近端新骨形成多于远端。因此，骨端骨髓溢出量是影响自发成骨的主要因素。
临床上骨水泥间隔多采用体内制作成型方式，即制作实心结构的骨水泥间隔，甚至早期学者提倡制作骨水泥间隔的“领子”包裹截骨端[2]，骨水泥很容易堵塞髓腔或截骨端。其次，骨水泥体内成型释放高热，导致截骨端热损伤、破坏活性[5, 22]。再者，临床采用Masquelet技术时骨水泥间隔包裹截骨端或过大、过小，没有维持适当的膜下空间。且该技术多用于开放性和感染性骨缺损，患者骨端骨膜剥离较多，而且术中反复行髓腔冲洗和术后负压吸引，虽然截骨端较干净，但活性较弱。加之髓内钉固定较少，不能激发髓腔内骨髓溢出。上述多方面原因最终导致临床罕见诱导膜自发成骨现象。
3.4 诱导膜自发成骨方式
本研究组织学检查示，诱导膜自发成骨的新骨中骨与软骨同时存在。Gruber等[9]在靠近截骨端诱导膜形成的少量唇状新骨中，也发现内层为软骨组织，外层为骨组织。源自骨端的骨膜和骨髓含骨形成细胞，其在诱导膜贴附、增殖分化为成骨细胞和成软骨细胞，并沿膜管向骨缺损中央方向爬行，不断形成新骨并矿化。多数学者认为膜引导性骨再生的新骨主要为软骨内成骨[4，19，21]。因此，Masquelet技术诱导膜自发成骨与其他合成膜材料引导的自发成骨一样，也属于软骨内成骨方式形成新骨。
综上述，尽管诱导膜具有成骨活性，但骨端髓腔内骨髓溢出提供MSCs才是诱导膜自发成骨的关键；诱导膜自发成骨属于软骨内成骨。临床有望利用诱导膜自发成骨现象的改良诱导膜技术修复骨缺损，但其发生机制需要进一步研究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经苏州大学附属无锡市第九人民医院医学伦理委员会批准（JY-KT20210132）；实验动物使用许可证批准号：SYXK-（苏）2021-0006
作者贡献声明 殷渠东：研究设计和实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写、经费支持；毛栋：研究实施、数据收集整理及统计分析；芮永军：研究指导、论文修改及经费支持
Masquelet技术，又称诱导膜技术，是临床常用的一种骨缺损修复方法。但是，目前对于该技术促进骨愈合的作用机制尚未完全明确，主要有以下3种理论：① 诱导膜具有保护性物理屏障，防止自体骨吸收作用；② 诱导膜含丰富的细胞（包括MSCs）以及与骨形成相关的营养因子；③ 诱导膜含丰富血管网，可侵入骨缺损区，从而避免骨吸收和坏死[1-6]。后两种理论提示诱导膜具有成骨活性，而且相关研究发现聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥间隔填塞动物股骨缺损后，在靠近骨端的诱导膜膜内形成了少量唇状新骨[7-9]。本课题组前期动物实验中也观察到诱导膜内新骨形成现象，在临床采用Masquelet技术治疗的患者中亦发现一期骨水泥植入手术后出现不同程度成骨，甚至修复部分骨缺损现象[10]。我们将未植骨但在诱导膜膜内形成新骨的现象称为“诱导膜自发成骨”，利用该现象有可能在不植骨或少量植骨条件下通过Masquelet技术修复骨缺损。然而，目前缺少诱导膜自发成骨原因的研究，为此我们基于大鼠模型进行探讨，以期为该技术应用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
7～9周龄SPF级雄性SD大鼠42只，体质量225～280 g，平均253 g，由苏州佰盛生物技术有限公司提供。术前大鼠适应性饲养1周，温度20～23℃，昼夜光照循环时间1∶1，湿度60%～80%。
万古霉素（浙江医药股份有限公司新昌制药厂）；医用级聚甲基丙烯酸甲酯（商品名：CMW 3；DePuy公司，英国）；小鼠抗大鼠STRO-1单克隆抗体 ［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（武汉塞维尔生物科技有限公司）。
硅胶模具（上海黑焰医疗科技有限公司）；6孔小钢板（商品名：宠物ALPS纯钛合金锁定重建骨板；广州市华创医疗器械有限公司）；光学显微镜（Nikon公司，日本）；Image J软件（美国国立卫生院）；游标卡尺（安徽砀山县通和量具有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 骨水泥间隔制备
将万古霉素与医用级聚甲基丙烯酸甲酯固体粉剂以1∶20比例混匀，然后与液剂混合，待呈“胶状”后倒入硅胶模具中成型。根据预实验结果成年大鼠股骨中段直径平均4 mm，本研究制备长度10 mm、直径4 mm的空心圆柱状骨水泥间隔，环氧乙烷灭菌备用。
1.2.2 动物模型制备及分组
取42只大鼠制备右后肢股骨中段临界骨缺损模型[11-12]。腹腔注射5%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，右后肢剃毛备皮，从股骨大转子至股骨外髁纵向切开皮肤、筋膜，切口长度约2.5 cm；在肌间隙分离显露股骨，在骨膜外将股骨中段与周围肌肉分离后牵开。使用摇摆锯在股骨中段截骨，截骨长度10 mm，移除中间骨干和骨膜。
将大鼠股骨缺损模型随机分为4组，其中A～C组各12只、D组6 只。A、B组：将骨水泥间隔以直径1.4 mm克氏针贯穿固定于两截骨端髓腔内，其中A组截骨端不作处理，B组用负载万古霉素的骨水泥包裹骨水泥间隔与截骨端连接处、封闭截骨端髓腔；C组：将骨水泥间隔用缝线捆绑于6孔小钢板上，然后钢板固定两截骨端；D组：骨缺损旷置，仅以6孔小钢板固定两截骨端。冲洗切口，可吸收缝线逐层缝合肌肉、浅筋膜和皮肤。见图1。术后3 d内每天肌肉注射青霉素钠4×104 U以防止感染，单笼饲养至切口愈合后混笼饲养。
图1
各组模型制备
a. 股骨截骨；b～e. A～D组骨缺损处理；f～i. A～D组骨缺损处理后X线片
Figure1. Preparation of models in each groupa. Femoral osteotomy; b-e. Bone defect treatment in groups A-D, respectively; f-i. X-ray films after bone defect treatment in groups A-D, respectively
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
术后观察各组大鼠存活及术后肢体活动恢复情况。
1.3.2 诱导膜MSCs含量观测
采用STRO-1免疫组织化学染色评估诱导膜中MSCs含量。术后5周，A～C组各取6只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥（120 mg/kg）处死后，按照原切口入路取诱导膜。为避免切取时损伤截骨端骨膜，均统一取诱导膜中段6 mm长组织进行观测。
将诱导膜置于10%甲醛中固定24 h后取出，制备5 μm厚切片。按照常规操作处理后，滴加STRO-1抗体（1∶200），4℃避光过夜孵育；滴加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗（1∶1 000），37℃孵育1 h；滴加DAB染色液，室温孵育10 min；苏木素染色液室温孵育30 s；脱水、透明、封片后光镜下观察，黄褐色染色细胞即为STRO-1阳性细胞。于400倍镜下每张切片选择3个视野，采用Image J软件行吸光度（A）值分析，记录阳性细胞所占百分比，作为MSCs含量，取均值。
1.3.3 诱导膜自发成骨观测
术后12周，取各组剩余大鼠同上法处死后进行以下观测。 ① X线片观察：摄正位X线片观察有无新骨形成，利用自带直尺测量新骨长度。② 大体观察：按照原切口入路显露股骨，取出内固定物和骨水泥间隔，观察诱导膜和成骨情况，并用游标卡尺测量诱导膜厚度。 ③ 组织学观察：取骨缺损段组织，其中未骨化组织经石蜡包埋、切片（厚3 μm）后常规HE染色；骨化组织按顺序置于4%多聚甲醛固定48 h、脱钙液浸泡1个月后，石蜡包埋、切片（厚度4 μm）后行番红O-固绿染色。光镜下观察组织构成。
1.4 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验均符合正态分布，数据以均数±标准表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
术后4组大鼠均存活至实验完成。术后切口均顺利愈合，大鼠恢复后肢运动功能。但D组4只大鼠于术后8～12周出现内固定物松动或失效，患肢活动减少，未作特殊处理。
2.2 诱导膜MSCs含量观测
术后5周免疫组织化学染色示B组呈阴性，A、C组均可见STRO-1阳性细胞， MSCs含量分别14.20%±1.92%和5.00%±0.71%，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
图2
A～C组术后5周免疫组织化学染色观察
a. A组（×400）； b. B组（×40）；c. C组（×400）
Figure2. Immunohistochemical staining observation of groups A-C at 5 weeks after operationa. Group A (×400); b. Group B (×40); c. Group C (×400)
2.3 诱导膜自发成骨观测
2.3.1 X线片检查
A组：截骨端与骨水泥间隔之间的间隙消失，新骨自截骨端向骨缺损中央生长并超过骨缺损中线，形成唇状包裹骨水泥间隔，一侧新骨长度为2～7 mm，平均3.1 mm。B组：截骨端未见新骨形成。C组：截骨端与骨水泥间隔之间的间隙部分消失，少量新骨形成，一侧新骨长度为0～3 mm，平均0.7 mm。D组：截骨端未见新骨形成且有骨萎缩。见图3。
图3
A～D组术后12周X线片观察
a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
Figure3. X-ray films of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.2 大体观察
A组：中段诱导膜厚度约1 mm，两端诱导膜质地较硬，均有不同程度唇状新骨沿诱导膜生长，其中骨缺损近端和切口深部侧形成的新骨较多。B组：诱导膜厚度均匀，约1 mm，质地较软，截骨端见骨萎缩。C组：诱导膜厚度约1 mm，靠近截骨端的诱导膜质地较硬、稍厚，并有少许新骨。D组：截骨端被软组织包裹，并发生骨吸收、骨萎缩，其中4只大鼠内固定物松动。见图4。
图4
A～D组术后12周大体观察
a. A组； b. B组； c. C组；d. D组
Figure4. Gross observation of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.3 组织学观察
4组中仅A、C组有新骨形成，取骨化组织行番红O-固绿染色，镜下见诱导膜中均含骨与软骨。HE染色示A～C组诱导膜中含少量新生血管和纤维组织；D组胶原纤维增生，可见较多成纤维细胞和少量新生血管。见图5。
图5
A～D组术后12周组织学观察（×200）
a、b. A、C组番红O-固绿染色； c～f. A～D组HE染色
Figure5. Histological observation of groups A-D at 12 weeks after operation (×200)a, b. Safranin O-green staining of groups A and C, respectively; c-f. HE staining of groups A-D, respectively
3 讨论
3.1 诱导膜作用
采用Masquelet技术修复骨缺损时形成的诱导膜具有以下作用：① 诱导膜和骨水泥间隔起到防止生长速度较快的软组织长入骨缺损部位作用。Klaue等[8]研究显示如果骨缺损处没有诱导膜和骨水泥间隔，纤维组织将向骨缺损处生长，骨端被纤维组织包裹，发生骨吸收和骨萎缩。本研究D组也观察到类似结果。② 诱导膜能分泌BMP-2、VEGF和TGF-β等成骨或成血管因子[13-18]，从而促进骨再生。③ 诱导膜和骨水泥间隔共同维持合适的膜下空间，在膜引导性骨再生和膜自发性成骨中发挥重要作用[10, 19]；同时，诱导膜起到吸引细胞和骨生长因子附着的生物支架作用，有利于血管长入和新骨形成。④ 诱导膜表面有丰富的微血管，可以增加骨移植部位的血运[2，11]。⑤ 诱导膜含骨形成细胞或骨祖细胞，主要是MSCs，可分化成成骨细胞[4，12-13]。
3.2 诱导膜自发成骨原因分析
对于影响骨缺损修复的关键要素，有学者提出了“钻石理论”，即骨缺损的成功修复需要骨诱导介质、骨形成细胞、骨传导基质（支架）、最佳机械环境、充足血运，以及解决宿主合并疾病，任何要素均不能缺乏[20]。
本研究大体观察见A组新骨形成最多，其次为C组，B组无自发成骨；而免疫组织化学染色结果亦提示A组诱导膜中MSCs含量最高，C组较少，B组诱导膜无MSCs，与大体观察成骨结果相对应。Mathieu等[4]、Henrich等[12]、Pélissier等[13]的研究发现只有位于骨缺损处的诱导膜才含MSCs，皮下形成的诱导膜不含MSCs。张浩等[21]的动物实验结果显示，与不堵塞组相比，髓腔堵塞组膜内形成新骨明显延迟且更少，提示膜引导性骨再生自发成骨的MSCs主要来自骨髓，该观点得到其他研究认同[19]。本研究A、B组均采用克氏针髓腔内固定，随着术后肢体活动，克氏针激发髓腔内骨髓溢出，故A组诱导膜中的MSCs多于钢板内固定的C组；而B组髓腔封闭，故没有骨髓溢出，诱导膜中则未见MSCs。所以A组有明显自发成骨现象，C组仅骨端少许新骨，B组没有新骨形成。本研究观测结果与上述研究一致，进一步明确截骨端骨髓溢出并提供MSCs，对诱导膜自发成骨起关键作用。
综上述，我们认为靠近截骨端的诱导膜具备上述“钻石理论”的关键要素，骨诱导介质、骨形成细胞（主要MSCs）、骨传导基质、较佳的机械环境（由内固定或外固定提供）和充足血运，所以可形成新骨（自发成骨）。
3.3 诱导膜自发成骨特点及影响因素
由于只有靠近截骨端才有骨髓中的MSCs溢出，诱导膜才有自发成骨现象，所以自发成骨呈现沿诱导膜自截骨端向骨缺损中央生长，在骨端形成明显唇状或尖齿状新骨，是其最明显特点。
诱导膜自发成骨另一特点是新骨形成呈现不均匀性，这与自发成骨影响因素有关，影响因素主要有溢出骨髓数量、诱导膜与骨缺损大小匹配度、诱导膜和截骨端的稳定性等。Wang等[11]研究显示截骨近端尤其是下方的诱导膜活性高于截骨远端和上方，因该部位残余骨髓和骨膜较多，所以在切口深部新骨较多；通常股骨近端位置较高，髓腔内骨髓容易溢出，所以近端新骨形成多于远端。因此，骨端骨髓溢出量是影响自发成骨的主要因素。
临床上骨水泥间隔多采用体内制作成型方式，即制作实心结构的骨水泥间隔，甚至早期学者提倡制作骨水泥间隔的“领子”包裹截骨端[2]，骨水泥很容易堵塞髓腔或截骨端。其次，骨水泥体内成型释放高热，导致截骨端热损伤、破坏活性[5, 22]。再者，临床采用Masquelet技术时骨水泥间隔包裹截骨端或过大、过小，没有维持适当的膜下空间。且该技术多用于开放性和感染性骨缺损，患者骨端骨膜剥离较多，而且术中反复行髓腔冲洗和术后负压吸引，虽然截骨端较干净，但活性较弱。加之髓内钉固定较少，不能激发髓腔内骨髓溢出。上述多方面原因最终导致临床罕见诱导膜自发成骨现象。
3.4 诱导膜自发成骨方式
本研究组织学检查示，诱导膜自发成骨的新骨中骨与软骨同时存在。Gruber等[9]在靠近截骨端诱导膜形成的少量唇状新骨中，也发现内层为软骨组织，外层为骨组织。源自骨端的骨膜和骨髓含骨形成细胞，其在诱导膜贴附、增殖分化为成骨细胞和成软骨细胞，并沿膜管向骨缺损中央方向爬行，不断形成新骨并矿化。多数学者认为膜引导性骨再生的新骨主要为软骨内成骨[4，19，21]。因此，Masquelet技术诱导膜自发成骨与其他合成膜材料引导的自发成骨一样，也属于软骨内成骨方式形成新骨。
综上述，尽管诱导膜具有成骨活性，但骨端髓腔内骨髓溢出提供MSCs才是诱导膜自发成骨的关键；诱导膜自发成骨属于软骨内成骨。临床有望利用诱导膜自发成骨现象的改良诱导膜技术修复骨缺损，但其发生机制需要进一步研究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经苏州大学附属无锡市第九人民医院医学伦理委员会批准（JY-KT20210132）；实验动物使用许可证批准号：SYXK-（苏）2021-0006
作者贡献声明 殷渠东：研究设计和实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写、经费支持；毛栋：研究实施、数据收集整理及统计分析；芮永军：研究指导、论文修改及经费支持
