引用本文： 陈国飞, 崔磊, 陈鹏, 李伟, 尤田, 王琛, 江长青, 刘岗. 化学萃取同种异体肌腱联合同种异体软骨细胞重建兔肩关节前盂唇实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(9): 1184-1189. doi: 10.7507/1002-1892.201911156 复制
盂唇损伤在体育运动中较常见，尤其是做投掷动作的运动项目中。盂唇损伤可导致肩关节疼痛及活动障碍，目前关节镜下盂唇修复被认为是治疗肩关节脱位和盂唇损伤的最佳方法[1-2]。随着关节镜技术的发展，大多数盂唇损伤通过关节镜修复缝合都可治愈[3]。但对于反复发生肩关节脱位的患者，盂唇损伤伴缺损难以缝合修复，需采用自体组织重建修补盂唇缺损。Paulos 等[4]采用盂唇重建术修复肩关节前盂唇不稳定，取得了满意效果。Bateman 等[5]报道可采用自体肌腱或同种异体肌腱移植重建治疗肩关节盂唇损伤。因此，盂唇重建可能是治疗肩关节疾病的一种有希望的方法。
盂唇缺损重建需要组织填充缺损处，组织来源包括自体或同种异体。有学者曾采用同种异体半月板组织移植替代盂唇[6]，但半月板组织来源有限。本研究基于同种异体组织填充盂唇缺损的可行性，设计在兔肩关节前盂唇缺损模型中采用同种异体肌腱重建盂唇。同种异体肌腱使用前需处理抗原排斥反应，可采用辐射照射方法，但容易破坏肌腱胶原结构导致生物力学特性降低[7]，生物力学改变又可导致移植物失去原有物理特性，出现移植物磨损失败。而采用化学萃取方法可对抗原进行灭活，最大程度保留肌腱胶原结构[8]，在移植物的选择上能够提供良好的生物力学特性。
另外，同种异体肌腱抗原灭活后移植体内需进一步考虑细胞长入替代愈合以及移植物吸收可能。本研究将同种异体软骨细胞体外分离培养后，再注射至已移植灭活抗原同种异体肌腱的关节腔内，通过与未注射软骨细胞模型比较，观察注射软骨细胞对促进移植物愈合、缩短愈合时间的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年雄性新西兰大白兔 45 只，体质量 2.5～3.0 kg，购自北京华富康生物科技有限公司。
无水乙醇、中性树脂、二甲苯（中国医药集团有限公司）；脱氧胆酸钠、多聚甲醛、Triton X-100（上海生工生物工程有限公司）；水合氯醛（阿拉丁控股集团有限公司）；PBS 粉末、ALP 标记链霉卵白素、中性树胶（北京中杉金桥生物有限公司）；苏木素染液、糖原染液（南京建成科技有限公司）；伊红染液（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗Ⅱ型胶原抗体（Abcam 公司，美国）；小牛血清、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；DMEM 培养基、FBS（GIBCO 公司，美国）；DMSO（Amresco 公司，美国）；阿利新蓝染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）。Sanyo-382AT 超低温冰箱、CO2 培养箱（Sanyo 公司，日本）；80、150、200 目不锈钢细胞筛（上海生工生物工程有限公司）；电热压力蒸汽消毒器（浙江绍兴医疗器械总厂）；倒置显微镜、照像系统（Olympus 公司，日本）；细胞计数板（上海医用仪器厂）；细胞培养瓶、细胞培养板（Costar 公司，美国）。
1.2 同种异体肌腱准备
取 15 只新西兰大白兔，腹腔注射 7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，剪开腿部皮肤，分离肌肉并充分暴露肌腱，剪下小腿跟腱组织，并修剪成每条长约 2 cm、直径约 0.3 cm，注意避免操作过程中夹取或牵拉肌腱。每只兔制作 4 条肌腱，共计 60 条。将其中 50 条肌腱采用化学萃取法处理[8]。取其中 10 条处理后肌腱（萃取组）与未经任何处理的 10 条肌腱（对照组），行 HE 染色并计数细胞核数量，采用 Masson 染色对比两组肌腱胶原纤维结构。
1.3 同种异体软骨细胞分离培养
取上述 15 只麻醉后新西兰大白兔，无菌条件下取出膝关节软骨，PBS 冲洗。将软骨组织剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小，移至离心管中，加 3 倍体积 0.25% 胰蛋白酶，置入 37℃ 恒温摇床中振荡消化 15～20 min，期间吹打 1 次；加入等体积完全培养基（含 10%FBS 的 DMEM 培养基）终止消化，然后以离心半径 13 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃上清； PBS 洗涤，去上清；加入 0.2%Ⅱ型胶原酶，置入 37℃ 恒温摇床中振荡消化 2 h；加入生长培养基（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的 DMED 培养基）终止消化，反复吹打后依次通过 200 目滤网；收集滤液，以离心半径 13 cm、1 200 r/min 离心 8 min，弃上清，用完全培养基重悬细胞。放入 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养，隔天换液，待细胞达 80% 融合时传代。细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全贴壁后即可固定，采用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行鉴定，取第 3 代细胞进行后续实验。
1.4 兔肩关节损伤模型相关观测
1.4.1 兔肩关节损伤模型建立及肌腱移植
参照 Abe 等[9]的方法制备兔前盂唇缺损模型。取剩余 30 只新西兰大白兔，7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）耳缘静脉注射麻醉，右前肢备皮、脱毛后仰卧位固定于操作台。于肩关节前侧纵向剪开皮肤约 4 cm，切开皮下组织及关节囊，钝性分离，切断肩胛下肌肌腱，暴露肱骨大、小结节；分离周围组织，极度外旋右前肢，暴露肱骨结节对侧关节盂，切除肩关节前下盂唇约 2 cm。将 30 条经化学萃取处理的同种异体肌腱植入兔肩关节，与肩关节内剩余盂唇吻合，填充被切除的盂唇，边缘与关节囊和关节盂周围软组织用 8-0 Prolene 线缝合固定。肌腱移植完毕后无菌 PBS、双氧水、聚维酮碘溶液反复冲洗关节腔，内旋肩关节，缝合肩胛下肌肌腱及关节囊，逐层缝合肌肉组织及皮肤。见图 1a、b。
图1
手术过程
a. 兔肩关节前盂唇缺损模型；b. 同种异体肌腱移植；c. 肩关节内注射同种异体软骨细胞
Figure1. Operation processa. Preparation of a rabbit model of anterior glenoid labrum defect; b. Allogeneic tendon transplantation; c. Intraarticular injection of allogeneic chondrocytes into the shoulder
1.4.2 实验分组及方法
将已移植同种异体肌腱的 30 只兔随机分为两组，A 组于关节间隙注射 2 mL 同种异体软骨细胞（含 4×105个细胞）[10]，见图 1c；B 组不作任何处理。术后动物分笼饲养，肌肉注射青霉素 80 万 U/只 3 d，保持充足饲料及饮水。
1.4.3 观测指标
① 大体观察：分别于术后 4、6、8 周，每组各取 5 只兔，同上法麻醉后取出移植肌腱，大体观察移植肌腱与周边组织愈合情况。② AB 染色观察：大体观察后取肌腱标本，常规行 AB 染色，用酶标仪于 600 nm 波长下测定吸光度（A）值，并根据标准曲线计算样品的糖胺聚糖含量。③ HE、Masson 染色观察：术后 6 周取肌腱标本，常规行 HE 染色计数肌腱组织中细胞核数量，Masson 染色观察肌腱内纤维组织情况。
1.5 统计学方法
采用 STATA21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 同种异体肌腱观测
Masson 染色示，萃取组和对照组肌腱的胶原纤维均平行排列成束，形态色泽及组织结构差别不大，萃取组较对照组稍松散。见图 2。HE 染色示，在 400 倍倒置显微镜下，萃取组肌腱中细胞核数量为 0，而对照组为（10±2）个/视野，差异有统计学意义（t=30.999，P=0.000）。见图 3。
图2
化学萃取前后肌腱 Masson 染色观察（倒置显微镜×400）
a. 萃取组；b. 对照组
Figure2. Masson staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)a. Extraction group; b. Control group
图3
化学萃取前后肌腱 HE 染色观察（倒置显微镜×400）a. 萃取组；b. 对照组
Figure3.
HE staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)
a. Extraction group; b. Control group
2.2 软骨细胞原代鉴定
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，软骨细胞细胞质及细胞膜被染成棕黄色，细胞核不着色，提示培养细胞为软骨细胞。见图 4。
图4
软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定倒置显微镜观察
a. ×100；b. ×400
Figure4. Identification of chondrocytes by collagen type Ⅱ immunohistochemistry staining under inverted microscopea.×100; b. ×400
2.3 兔肩关节损伤模型相关观测
2.3.1 大体观察
术后 4 周，A、B 组移植肌腱均未愈合，但 A 组肌腱与肩关节周围组织缝隙小于 B 组。术后 6 周，A 组均已完全愈合；B 组移植肌腱仅 2 例完全愈合，2 例仍有约长 0.5 cm、宽 0.3 cm 未完全愈合，1 例未见愈合。术后 8 周，A 组完全愈合无变化；而 B 组移植肌腱仍仅有 2 例完全愈合，1 例肌腱出现部分吸收缩小，2 例部分愈合存留缝隙。见图 5。
图5
术后 8 周两组移植肌腱大体观察
a. A 组完全愈合；b. B 组 1 例肌腱吸收
Figure5. General observation of tendon grafts in two groups at 8 weeks after operationa. Complete healing in group A; b. One case of tendon absorption in group B
2.3.2 AB 染色观察
A 组术后 6、8 周糖胺聚糖含量显著高于术后 4 周，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 6、8 周间差异无统计学意义（P>0.05）。B 组术后 8 周糖胺聚糖含量显著高于术后 4、6 周，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 4、6 周间差异无统计学意义（P>0.05）。术后各时间点 A 组糖胺聚糖含量均显著高于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1、图 6。
表1
术后各时间点两组 AB 染色检测糖胺聚糖含量（n=5，
，μg/mL）
Table1.
Detection of glycosaminoglycan content by AB staining at each time point after operation (n=5, 
, μg/mL)
图6
术后 6 周两组肌腱组织 AB 染色观察（倒置显微镜×400）
a. A 组；b. B 组
Figure6. AB staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.3 HE 染色
术后 6 周 400 倍镜下观察示，A 组肌腱组织内的细胞核数量为（69.8±3.8）个/视野，明显多于 B 组的（34.4±3.4）个/视野，差异有统计学意义（t=20.043，P=0.000）。见图 7。
图7
术后 6 周两组肌腱组织 HE 染色观察（倒置显微镜×400）
a. A 组；b. B 组
Figure7. HE staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.4 Masson 染色
术后 6 周，A 组肌腱组织中的细胞核明显增多，肌纤维及胶原纤维相互交错，组织结构更加紧凑，肌腱组织以蓝染为主；而 B 组细胞核较少，主要为原移植物的胶原纤维。见图 8。
图8
术后 6 周两组肌腱组织 Masson 染色观察（倒置显微镜×400）
a. A 组；b. B 组
Figure8. Masson staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
3 讨论
3.1 肌腱移植物的来源
肩关节盂唇损伤常见的是前盂唇损伤或缺损，重建盂唇是比较有效的方法。可选择肌腱移植重建[10-11]，肌腱来源包括自体肌腱及同种异体肌腱。自体肌腱虽无排斥反应[12]，但来源有限，难以满足临床需求，且取自体肌腱会增加切口创伤。而同种异体肌腱来源广泛，能够满足临床需求，但其应用面临免疫排斥反应的问题[13-14]，直接将未经抗原灭活处理的同种异体肌腱移植至体内，可导致手术失败甚至危及患者生命安全。所以采用同种异体肌腱必须经过抗原灭活处理，但同种异体肌腱经灭活处理后，可能导致组织结构破坏而引起强度改变。目前最常用的同种异体肌腱灭活方法为辐射照射，经辐照后的肌腱常出现肌腱纤维组织破坏，抗拉性及组织韧性降低[7]。另外，经过辐射照射的同种异体肌腱保存方法多采用低温冰冻保存，这加重了对肌腱结构的损伤，导致肌腱生物力学性能下降[14]，肌腱抗拉强度及拉伸强度下降将导致手术失败。
因此，应尽可能地保留同种异体肌腱强度来降低手术失败风险，尽可能保护肌腱原有的纤维组织结构不受破坏，肌腱原有纤维组织保存越好，肌腱的抗拉性及组织韧性越完整。本研究中，我们采用化学萃取法灭活肌腱的抗原活性[8，15]，既灭活了抗原活性，对肌腱的纤维结构破坏也较小。HE 和 Masson 染色结果显示，经化学萃取后的肌腱中细胞核消失，且肌腱纤维未被破坏，保证了肌腱的韧性结构。提示采用该方法灭活抗原后的同种异体肌腱能够为盂唇重建提供支架材料，保证了力学稳定性和移植安全性。
3.2 肌腱移植后的状况
实验中我们采用兔肩关节进行造模，打开兔肩关节并切除部分前盂唇，模拟肩关节前盂唇缺损；再将经化学萃取处理的同种异体肌腱移植至肩关节与剩余盂唇吻合，模拟了肩关节盂唇损伤重建。将化学萃取后的同种异体肌腱移植后需观察愈合情况，肌腱如带有抗原活性，容易造成免疫排斥反应及相关炎症反应，导致切口不愈合及感染可能。本研究中实验动物均未发生切口感染不愈合现象，提示经化学萃取后的肌腱与受体有较好的组织相容性。将同种异体肌腱移植至兔肩关节内需考虑细胞附着成活生长问题，肌腱在体内愈合时间越长，越可能出现不愈合或吸收。为了促进移植肌腱的愈合，缩短愈合时间，防止移植后肌腱吸收，本研究在肌腱移植后于关节内注射同种异体软骨细胞（A 组），并与移植后未作任何处理的 B 组进行比较。大体观察愈合情况显示，同时间点 B 组肌腱与周边组织缝隙大于 A 组，说明未注射同种异体软骨细胞的 B 组愈合速度慢于 A 组，并且随时间增加，不愈合肌腱可出现肌腱的吸收消失。而 A 组移植肌腱术后 6 周与周边组织完全愈合，并且未出现肌腱移植后吸收，说明注射软骨细胞有助于肌腱组织爬行替代。
3.3 关于种子细胞的选择
盂唇组织细胞以纤维软骨细胞为主，在移植细胞方面可选择纤维软骨细胞、BMSCs 及透明软骨细胞。纤维软骨细胞可来源于半月板组织，但取纤维软骨细胞可能损伤正常的半月板或供体组织；BMSCs 分化能力较强，且取材方便，但向肌纤维组织或其他组织细胞分化可能难以控制。透明软骨细胞在生物力学抗压及弹性方面优于纤维软骨细胞，取材方便，临床中可使用非功能区的透明软骨细胞[16]。透明软骨细胞的培养国内外已有较多研究和方法，而且细胞分化固定，软骨细胞常在培养至第 3 代时出现生长抑制及向纤维细胞分化[17]，而盂唇组织虽为软骨细胞组织，但以纤维软骨细胞为主，即使透明软骨细胞向纤维细胞分化也接近盂唇组织细胞，所以本实验中选择透明软骨细胞进行培养及后续的注射。
3.4 细胞与肌腱的体内或体外联合培养
在细胞联合培养方面，可采用肌腱与细胞体外联合培养再回植。但肌腱体外联合细胞培养时，需考虑到细胞培养周期，周期短难以长入，而周期长会出现细胞增殖能力减弱并老化[18]，还容易增加细胞污染概率导致失败。所以我们采用肌腱移植后再注射软骨细胞，于体外软骨细胞培养增殖后[19]，再将富含软骨细胞的细胞液回植到已移植同种异体肌腱的肩关节内。
在将细胞液注射到肩关节内时机的选择上，主要考虑肩关节内软骨细胞浓度的维持。如术中将软骨细胞直接注射到肌腱，关节囊未缝合关闭情况下容易发生细胞外漏，细胞浓度难以控制。所以我们待关节周围软组织缝合，关节腔已封闭后立即将富含软骨细胞的细胞液注入，不易发生细胞外漏，能够维持细胞浓度。术后取材时机的选择主要根据细胞注射移植后 4 周为细胞增生期，同时组织 4 周左右会有替代细胞长入及部分愈合，6～8 周是细胞过渡期，一般会有大量胶原细胞分泌[20]，所以我们分别于 4、6、8 周进行取样对比。
经过对比实验动物体内注射（A 组）与未注射软骨细胞的同种异体肌腱（B 组）中细胞的生长情况，结果显示前者能够更好地促进肌腱内细胞的爬行生长。与 B 组相比，HE 染色可见 A 组细胞数明显增多，AB 染色示 A 组糖胺聚糖水平明显增高，Masson 染色示 A 组肌纤维及胶原纤维相互交错、组织结构更加紧凑。说明移植同种异体肌腱后联合软骨细胞注射的 A 组肌腱内有纤维细胞或非软骨细胞存在，其胶原纤维更加紧密，在生物力学性能方面更优异。
综上述，经化学萃取法灭活抗原的同种异体肌腱，能够治疗兔肩关节前盂唇缺损，且联合同种异体软骨细胞能够促进肌腱移植的愈合。虽然未注射软骨细胞的同种异体肌腱也愈合，但肌腱内的细胞爬行替代较少。本研究不足之处在于未将术后两组肌腱进行生物力学对比检测，将在后续研究中进一步改善。
作者贡献：陈国飞负责实验资料收集，参与整个实验过程；崔磊查阅文献并提供相关资料参考；陈鹏在肌腱化学萃取方法上提供技术指导；李伟、尤田、王琛、刘岗在动物模型上帮助手术及协助动物管理；江长青为课题总负责人，主导实验进程。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：所有动物实验经北京大学深圳医院实验动物伦理委员会批准（2018031682）。实验动物使用许可证号：SYXK-（粤）2018-0106。
盂唇损伤在体育运动中较常见，尤其是做投掷动作的运动项目中。盂唇损伤可导致肩关节疼痛及活动障碍，目前关节镜下盂唇修复被认为是治疗肩关节脱位和盂唇损伤的最佳方法[1-2]。随着关节镜技术的发展，大多数盂唇损伤通过关节镜修复缝合都可治愈[3]。但对于反复发生肩关节脱位的患者，盂唇损伤伴缺损难以缝合修复，需采用自体组织重建修补盂唇缺损。Paulos 等[4]采用盂唇重建术修复肩关节前盂唇不稳定，取得了满意效果。Bateman 等[5]报道可采用自体肌腱或同种异体肌腱移植重建治疗肩关节盂唇损伤。因此，盂唇重建可能是治疗肩关节疾病的一种有希望的方法。
盂唇缺损重建需要组织填充缺损处，组织来源包括自体或同种异体。有学者曾采用同种异体半月板组织移植替代盂唇[6]，但半月板组织来源有限。本研究基于同种异体组织填充盂唇缺损的可行性，设计在兔肩关节前盂唇缺损模型中采用同种异体肌腱重建盂唇。同种异体肌腱使用前需处理抗原排斥反应，可采用辐射照射方法，但容易破坏肌腱胶原结构导致生物力学特性降低[7]，生物力学改变又可导致移植物失去原有物理特性，出现移植物磨损失败。而采用化学萃取方法可对抗原进行灭活，最大程度保留肌腱胶原结构[8]，在移植物的选择上能够提供良好的生物力学特性。
另外，同种异体肌腱抗原灭活后移植体内需进一步考虑细胞长入替代愈合以及移植物吸收可能。本研究将同种异体软骨细胞体外分离培养后，再注射至已移植灭活抗原同种异体肌腱的关节腔内，通过与未注射软骨细胞模型比较，观察注射软骨细胞对促进移植物愈合、缩短愈合时间的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年雄性新西兰大白兔 45 只，体质量 2.5～3.0 kg，购自北京华富康生物科技有限公司。
无水乙醇、中性树脂、二甲苯（中国医药集团有限公司）；脱氧胆酸钠、多聚甲醛、Triton X-100（上海生工生物工程有限公司）；水合氯醛（阿拉丁控股集团有限公司）；PBS 粉末、ALP 标记链霉卵白素、中性树胶（北京中杉金桥生物有限公司）；苏木素染液、糖原染液（南京建成科技有限公司）；伊红染液（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗Ⅱ型胶原抗体（Abcam 公司，美国）；小牛血清、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；DMEM 培养基、FBS（GIBCO 公司，美国）；DMSO（Amresco 公司，美国）；阿利新蓝染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司）。Sanyo-382AT 超低温冰箱、CO2 培养箱（Sanyo 公司，日本）；80、150、200 目不锈钢细胞筛（上海生工生物工程有限公司）；电热压力蒸汽消毒器（浙江绍兴医疗器械总厂）；倒置显微镜、照像系统（Olympus 公司，日本）；细胞计数板（上海医用仪器厂）；细胞培养瓶、细胞培养板（Costar 公司，美国）。
1.2 同种异体肌腱准备
取 15 只新西兰大白兔，腹腔注射 7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，剪开腿部皮肤，分离肌肉并充分暴露肌腱，剪下小腿跟腱组织，并修剪成每条长约 2 cm、直径约 0.3 cm，注意避免操作过程中夹取或牵拉肌腱。每只兔制作 4 条肌腱，共计 60 条。将其中 50 条肌腱采用化学萃取法处理[8]。取其中 10 条处理后肌腱（萃取组）与未经任何处理的 10 条肌腱（对照组），行 HE 染色并计数细胞核数量，采用 Masson 染色对比两组肌腱胶原纤维结构。
1.3 同种异体软骨细胞分离培养
取上述 15 只麻醉后新西兰大白兔，无菌条件下取出膝关节软骨，PBS 冲洗。将软骨组织剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小，移至离心管中，加 3 倍体积 0.25% 胰蛋白酶，置入 37℃ 恒温摇床中振荡消化 15～20 min，期间吹打 1 次；加入等体积完全培养基（含 10%FBS 的 DMEM 培养基）终止消化，然后以离心半径 13 cm、1 000 r/min 离心 5 min，弃上清； PBS 洗涤，去上清；加入 0.2%Ⅱ型胶原酶，置入 37℃ 恒温摇床中振荡消化 2 h；加入生长培养基（含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的 DMED 培养基）终止消化，反复吹打后依次通过 200 目滤网；收集滤液，以离心半径 13 cm、1 200 r/min 离心 8 min，弃上清，用完全培养基重悬细胞。放入 37℃、5%CO2 细胞培养箱中培养，隔天换液，待细胞达 80% 融合时传代。细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全贴壁后即可固定，采用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行鉴定，取第 3 代细胞进行后续实验。
1.4 兔肩关节损伤模型相关观测
1.4.1 兔肩关节损伤模型建立及肌腱移植
参照 Abe 等[9]的方法制备兔前盂唇缺损模型。取剩余 30 只新西兰大白兔，7% 水合氯醛（0.5 mL/100 g）耳缘静脉注射麻醉，右前肢备皮、脱毛后仰卧位固定于操作台。于肩关节前侧纵向剪开皮肤约 4 cm，切开皮下组织及关节囊，钝性分离，切断肩胛下肌肌腱，暴露肱骨大、小结节；分离周围组织，极度外旋右前肢，暴露肱骨结节对侧关节盂，切除肩关节前下盂唇约 2 cm。将 30 条经化学萃取处理的同种异体肌腱植入兔肩关节，与肩关节内剩余盂唇吻合，填充被切除的盂唇，边缘与关节囊和关节盂周围软组织用 8-0 Prolene 线缝合固定。肌腱移植完毕后无菌 PBS、双氧水、聚维酮碘溶液反复冲洗关节腔，内旋肩关节，缝合肩胛下肌肌腱及关节囊，逐层缝合肌肉组织及皮肤。见图 1a、b。
图1
手术过程
a. 兔肩关节前盂唇缺损模型；b. 同种异体肌腱移植；c. 肩关节内注射同种异体软骨细胞
Figure1. Operation processa. Preparation of a rabbit model of anterior glenoid labrum defect; b. Allogeneic tendon transplantation; c. Intraarticular injection of allogeneic chondrocytes into the shoulder
1.4.2 实验分组及方法
将已移植同种异体肌腱的 30 只兔随机分为两组，A 组于关节间隙注射 2 mL 同种异体软骨细胞（含 4×105个细胞）[10]，见图 1c；B 组不作任何处理。术后动物分笼饲养，肌肉注射青霉素 80 万 U/只 3 d，保持充足饲料及饮水。
1.4.3 观测指标
① 大体观察：分别于术后 4、6、8 周，每组各取 5 只兔，同上法麻醉后取出移植肌腱，大体观察移植肌腱与周边组织愈合情况。② AB 染色观察：大体观察后取肌腱标本，常规行 AB 染色，用酶标仪于 600 nm 波长下测定吸光度（A）值，并根据标准曲线计算样品的糖胺聚糖含量。③ HE、Masson 染色观察：术后 6 周取肌腱标本，常规行 HE 染色计数肌腱组织中细胞核数量，Masson 染色观察肌腱内纤维组织情况。
1.5 统计学方法
采用 STATA21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 同种异体肌腱观测
Masson 染色示，萃取组和对照组肌腱的胶原纤维均平行排列成束，形态色泽及组织结构差别不大，萃取组较对照组稍松散。见图 2。HE 染色示，在 400 倍倒置显微镜下，萃取组肌腱中细胞核数量为 0，而对照组为（10±2）个/视野，差异有统计学意义（t=30.999，P=0.000）。见图 3。
图2
化学萃取前后肌腱 Masson 染色观察（倒置显微镜×400）
a. 萃取组；b. 对照组
Figure2. Masson staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)a. Extraction group; b. Control group
图3
化学萃取前后肌腱 HE 染色观察（倒置显微镜×400）a. 萃取组；b. 对照组
Figure3.
HE staining of tendon before and after chemical extraction (Inverted microscope×400)
a. Extraction group; b. Control group
2.2 软骨细胞原代鉴定
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示，软骨细胞细胞质及细胞膜被染成棕黄色，细胞核不着色，提示培养细胞为软骨细胞。见图 4。
图4
软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定倒置显微镜观察
a. ×100；b. ×400
Figure4. Identification of chondrocytes by collagen type Ⅱ immunohistochemistry staining under inverted microscopea.×100; b. ×400
2.3 兔肩关节损伤模型相关观测
2.3.1 大体观察
术后 4 周，A、B 组移植肌腱均未愈合，但 A 组肌腱与肩关节周围组织缝隙小于 B 组。术后 6 周，A 组均已完全愈合；B 组移植肌腱仅 2 例完全愈合，2 例仍有约长 0.5 cm、宽 0.3 cm 未完全愈合，1 例未见愈合。术后 8 周，A 组完全愈合无变化；而 B 组移植肌腱仍仅有 2 例完全愈合，1 例肌腱出现部分吸收缩小，2 例部分愈合存留缝隙。见图 5。
图5
术后 8 周两组移植肌腱大体观察
a. A 组完全愈合；b. B 组 1 例肌腱吸收
Figure5. General observation of tendon grafts in two groups at 8 weeks after operationa. Complete healing in group A; b. One case of tendon absorption in group B
2.3.2 AB 染色观察
A 组术后 6、8 周糖胺聚糖含量显著高于术后 4 周，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 6、8 周间差异无统计学意义（P>0.05）。B 组术后 8 周糖胺聚糖含量显著高于术后 4、6 周，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 4、6 周间差异无统计学意义（P>0.05）。术后各时间点 A 组糖胺聚糖含量均显著高于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1、图 6。
表1
术后各时间点两组 AB 染色检测糖胺聚糖含量（n=5，，μg/mL）
Table1.
Detection of glycosaminoglycan content by AB staining at each time point after operation (n=5, , μg/mL)
图6
术后 6 周两组肌腱组织 AB 染色观察（倒置显微镜×400）
a. A 组；b. B 组
Figure6. AB staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.3 HE 染色
术后 6 周 400 倍镜下观察示，A 组肌腱组织内的细胞核数量为（69.8±3.8）个/视野，明显多于 B 组的（34.4±3.4）个/视野，差异有统计学意义（t=20.043，P=0.000）。见图 7。
图7
术后 6 周两组肌腱组织 HE 染色观察（倒置显微镜×400）
a. A 组；b. B 组
Figure7. HE staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
2.3.4 Masson 染色
术后 6 周，A 组肌腱组织中的细胞核明显增多，肌纤维及胶原纤维相互交错，组织结构更加紧凑，肌腱组织以蓝染为主；而 B 组细胞核较少，主要为原移植物的胶原纤维。见图 8。
图8
术后 6 周两组肌腱组织 Masson 染色观察（倒置显微镜×400）
a. A 组；b. B 组
Figure8. Masson staining of tendon tissue at 6 weeks after operation (Inverted microscope×400)a. Group A; b. Group B
3 讨论
3.1 肌腱移植物的来源
肩关节盂唇损伤常见的是前盂唇损伤或缺损，重建盂唇是比较有效的方法。可选择肌腱移植重建[10-11]，肌腱来源包括自体肌腱及同种异体肌腱。自体肌腱虽无排斥反应[12]，但来源有限，难以满足临床需求，且取自体肌腱会增加切口创伤。而同种异体肌腱来源广泛，能够满足临床需求，但其应用面临免疫排斥反应的问题[13-14]，直接将未经抗原灭活处理的同种异体肌腱移植至体内，可导致手术失败甚至危及患者生命安全。所以采用同种异体肌腱必须经过抗原灭活处理，但同种异体肌腱经灭活处理后，可能导致组织结构破坏而引起强度改变。目前最常用的同种异体肌腱灭活方法为辐射照射，经辐照后的肌腱常出现肌腱纤维组织破坏，抗拉性及组织韧性降低[7]。另外，经过辐射照射的同种异体肌腱保存方法多采用低温冰冻保存，这加重了对肌腱结构的损伤，导致肌腱生物力学性能下降[14]，肌腱抗拉强度及拉伸强度下降将导致手术失败。
因此，应尽可能地保留同种异体肌腱强度来降低手术失败风险，尽可能保护肌腱原有的纤维组织结构不受破坏，肌腱原有纤维组织保存越好，肌腱的抗拉性及组织韧性越完整。本研究中，我们采用化学萃取法灭活肌腱的抗原活性[8，15]，既灭活了抗原活性，对肌腱的纤维结构破坏也较小。HE 和 Masson 染色结果显示，经化学萃取后的肌腱中细胞核消失，且肌腱纤维未被破坏，保证了肌腱的韧性结构。提示采用该方法灭活抗原后的同种异体肌腱能够为盂唇重建提供支架材料，保证了力学稳定性和移植安全性。
3.2 肌腱移植后的状况
实验中我们采用兔肩关节进行造模，打开兔肩关节并切除部分前盂唇，模拟肩关节前盂唇缺损；再将经化学萃取处理的同种异体肌腱移植至肩关节与剩余盂唇吻合，模拟了肩关节盂唇损伤重建。将化学萃取后的同种异体肌腱移植后需观察愈合情况，肌腱如带有抗原活性，容易造成免疫排斥反应及相关炎症反应，导致切口不愈合及感染可能。本研究中实验动物均未发生切口感染不愈合现象，提示经化学萃取后的肌腱与受体有较好的组织相容性。将同种异体肌腱移植至兔肩关节内需考虑细胞附着成活生长问题，肌腱在体内愈合时间越长，越可能出现不愈合或吸收。为了促进移植肌腱的愈合，缩短愈合时间，防止移植后肌腱吸收，本研究在肌腱移植后于关节内注射同种异体软骨细胞（A 组），并与移植后未作任何处理的 B 组进行比较。大体观察愈合情况显示，同时间点 B 组肌腱与周边组织缝隙大于 A 组，说明未注射同种异体软骨细胞的 B 组愈合速度慢于 A 组，并且随时间增加，不愈合肌腱可出现肌腱的吸收消失。而 A 组移植肌腱术后 6 周与周边组织完全愈合，并且未出现肌腱移植后吸收，说明注射软骨细胞有助于肌腱组织爬行替代。
3.3 关于种子细胞的选择
盂唇组织细胞以纤维软骨细胞为主，在移植细胞方面可选择纤维软骨细胞、BMSCs 及透明软骨细胞。纤维软骨细胞可来源于半月板组织，但取纤维软骨细胞可能损伤正常的半月板或供体组织；BMSCs 分化能力较强，且取材方便，但向肌纤维组织或其他组织细胞分化可能难以控制。透明软骨细胞在生物力学抗压及弹性方面优于纤维软骨细胞，取材方便，临床中可使用非功能区的透明软骨细胞[16]。透明软骨细胞的培养国内外已有较多研究和方法，而且细胞分化固定，软骨细胞常在培养至第 3 代时出现生长抑制及向纤维细胞分化[17]，而盂唇组织虽为软骨细胞组织，但以纤维软骨细胞为主，即使透明软骨细胞向纤维细胞分化也接近盂唇组织细胞，所以本实验中选择透明软骨细胞进行培养及后续的注射。
3.4 细胞与肌腱的体内或体外联合培养
在细胞联合培养方面，可采用肌腱与细胞体外联合培养再回植。但肌腱体外联合细胞培养时，需考虑到细胞培养周期，周期短难以长入，而周期长会出现细胞增殖能力减弱并老化[18]，还容易增加细胞污染概率导致失败。所以我们采用肌腱移植后再注射软骨细胞，于体外软骨细胞培养增殖后[19]，再将富含软骨细胞的细胞液回植到已移植同种异体肌腱的肩关节内。
在将细胞液注射到肩关节内时机的选择上，主要考虑肩关节内软骨细胞浓度的维持。如术中将软骨细胞直接注射到肌腱，关节囊未缝合关闭情况下容易发生细胞外漏，细胞浓度难以控制。所以我们待关节周围软组织缝合，关节腔已封闭后立即将富含软骨细胞的细胞液注入，不易发生细胞外漏，能够维持细胞浓度。术后取材时机的选择主要根据细胞注射移植后 4 周为细胞增生期，同时组织 4 周左右会有替代细胞长入及部分愈合，6～8 周是细胞过渡期，一般会有大量胶原细胞分泌[20]，所以我们分别于 4、6、8 周进行取样对比。
经过对比实验动物体内注射（A 组）与未注射软骨细胞的同种异体肌腱（B 组）中细胞的生长情况，结果显示前者能够更好地促进肌腱内细胞的爬行生长。与 B 组相比，HE 染色可见 A 组细胞数明显增多，AB 染色示 A 组糖胺聚糖水平明显增高，Masson 染色示 A 组肌纤维及胶原纤维相互交错、组织结构更加紧凑。说明移植同种异体肌腱后联合软骨细胞注射的 A 组肌腱内有纤维细胞或非软骨细胞存在，其胶原纤维更加紧密，在生物力学性能方面更优异。
综上述，经化学萃取法灭活抗原的同种异体肌腱，能够治疗兔肩关节前盂唇缺损，且联合同种异体软骨细胞能够促进肌腱移植的愈合。虽然未注射软骨细胞的同种异体肌腱也愈合，但肌腱内的细胞爬行替代较少。本研究不足之处在于未将术后两组肌腱进行生物力学对比检测，将在后续研究中进一步改善。
作者贡献：陈国飞负责实验资料收集，参与整个实验过程；崔磊查阅文献并提供相关资料参考；陈鹏在肌腱化学萃取方法上提供技术指导；李伟、尤田、王琛、刘岗在动物模型上帮助手术及协助动物管理；江长青为课题总负责人，主导实验进程。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：所有动物实验经北京大学深圳医院实验动物伦理委员会批准（2018031682）。实验动物使用许可证号：SYXK-（粤）2018-0106。
