引用本文： 孙红, 张志奇, 黄志宇, 毛谷平, 余宝禧, 张程云, 傅明. 成软骨相关 miR-4287 调控人软骨细胞聚蛋白多糖酶-1 表达的研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(12): 1468-1473. doi: 10.7507/1002-1892.201704065 复制
软骨细胞外基质是关节软骨的重要组成部分，其进行性丢失是关节软骨退变的特征性改变[1]。软骨细胞外基质代谢包括合成代谢和分解代谢，正常软骨组织中两者处于动态平衡，而骨关节炎软骨组织中分解代谢占优势。聚蛋白多糖酶-1 是软骨细胞外基质分解代谢的重要酶类，属于带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族，即 ADAMTS4。ADAMTS4 具有切割、水解作用，广泛参与软骨细胞外基质聚蛋白多糖降解[2]。近年来研究发现，miRNA 在骨关节炎软骨细胞外基质代谢中扮演着重要角色[3]。miRNA 通过负性调控软骨细胞外基质代谢相关基因表达，从而稳定或打破软骨基质代谢内环境平衡[4]。miR-320、miR-455-3p、miR-92a 等在软骨形成过程中具有重要作用，同时这些与软骨形成相关的 miRNA 也参与了骨关节炎软骨细胞外基质代谢调控[5-8]。
本课题组前期研究结果表明，miR-4287 在脂肪干细胞诱导成软骨过程中发生了差异性表达，提示其与软骨形成密切相关[8]，但目前 miR-4287 在软骨细胞外基质代谢中的作用尚未见报道。生物信息学提示 ADAMTS4 mRNA 3’ 非翻译区（untranslated region，UTR）存在 miR-4287 结合位点。因此，我们推测 miR-4287 可能以直接结合方式抑制软骨细胞 ADAMTS4 表达。本研究应用 IL-1β 处理软骨细胞，诱导炎症模型产生，通过实时荧光定量 PCR 检测 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达；并进一步转染 miR-4287 模拟物和抑制物，探讨 miR-4287 对软骨细胞 ADAMTS4 的调控作用及机制。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验标本
膝关节软骨组织取自 2016 年 8 月—2017 年 1 月于中山大学附属第一医院关节外科或骨肿瘤科住院患者，取材经过中山大学附属第一医院伦理委员会批准以及患者及家属知情同意。其中，正常软骨取自 10 例行截肢术或保肢-肿瘤型膝关节假体置换术患者的股骨髁、胫骨平台；男 7 例，女 3 例；年龄 12～50 岁，平均 23.5 岁。骨关节炎软骨取自 23 例因骨关节炎行人工全膝关节置换术患者的股骨髁、胫骨平台；男 7 例，女 15 例；年龄 50～81 岁，平均 69.9 岁。
1.2 主要试剂及仪器
IL-1β（PeproTech 公司，美国）；胶原酶（Sigma 公司，美国）；MAPK 信号通路抑制剂 SP600125、NF-κB 信号通路抑制剂 SN50（Calbiochem 公司，美国）；miR-4287 模拟物及其阴性对照、miR-4287 抑制物及其阴性对照（广州锐博生物材料有限公司）；转染试剂 Lipofectamine® 2000、优化培养基 OPTI-MEM（Life Technologies 公司，美国）；兔抗鼠 ADAMTS4 抗体、兔抗鼠 GAPDH 抗体（Millipore 公司，美国）；RIPA 裂解液、丝氨酸蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白定量试剂盒、山羊抗兔二抗（北京康为世纪生物科技有限公司）；荧光素酶报告载体构建由上海和元生物技术有限公司完成。
CO2 恒温培养箱（Thermo Forma 公司，美国）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；倒置相差显微镜（Thermo Shandn 公司，美国）；低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；超微量紫外分光光度计（BioTek 公司，美国）；普通梯度 PCR 仪（BIAMETRA 公司，德国）；实时荧光定量 PCR 系统 ABI ViiATM7Dx（Applied Biosystems 公司，美国）；超灵敏化学发光成像仪（GE 公司，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 软骨细胞分离培养
无菌条件下，将正常及骨关节炎软骨组织分别置于 10 cm 培养皿中，尽量剪碎软骨组织，并称重。PBS 清洗后加入 0.25% 胰蛋白酶，于 37℃ 培养箱中振荡消化 30 min，弃上清，PBS 清洗 3 次；加入 1 ng/mL 胶原酶，于 37℃ 培养箱中振荡消化 4～6 h，用 70 μm 细胞滤网过滤，1 500×g 离心 5 min，收集细胞。将正常及骨关节炎软骨细胞分别接种于 25 cm2或 75 cm2培养瓶中，置于 37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养，隔天换液 1 次，取第 1 代细胞用于后续实验。
1.3.2 正常及骨关节炎软骨组织中 miR-4287 和 ADAMTS4 表达情况
取正常及骨关节炎软骨组织，尽量剪碎后并置于研磨皿中。加入液氮，快速研磨后加入适量 Trizol 试剂，总 RNA 抽提后使用实时荧光定量 PCR 检测组织内 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达量。
1.3.3 IL-1β 对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
将生长状态良好的骨关节炎软骨细胞按 3×105个/孔接种于 12 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养，24 h 后更换含 5 ng/mL IL-1β 的无血清培养基继续培养。分别于培养 3、6、12 h 收集 2～3 孔细胞，采用实时荧光定量 PCR 检测 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达量。以正常培养 3、6、12 h 的骨关节炎软骨细胞作为对照组。实验重复 3 次。
1.3.4 IL-1β 介导的信号通路对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
取骨关节炎软骨细胞，按 1×105个/孔接种于 24 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养。24 h 后分别给予 10 μmol/L MAPK 信号通路抑制剂 SP600125 以及 5 μmol/L NF-κB 信号通路抑制剂 SN50，预处理 2 h；然后加入 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h，取细胞采用实时荧光定量 PCR 检测 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达量。以单纯 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h 处理的骨关节炎软骨细胞作为对照。实验重复 3 次。
1.3.5 miR-4287 调控软骨细胞 ADAMTS4 表达观察
取骨关节炎软骨细胞，按 3×105个/孔接种于 12 孔板，加入不含抗生素的培养基培养 24 h 后，将细胞随机分为 4 组，参照 Lipofectamine® 2000 说明书，分别采用 50 μmol/L miR-4287 模拟物和阴性对照模拟物、100 μmol/L miR-4287 抑制物和阴性对照抑制物进行转染。转染 48 h 后收集各组细胞，采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 ADAMTS4 mRNA 及蛋白表达量。
1.4 检测方法
1.4.1 实时荧光定量 PCR 检测
取收集的软骨细胞进行总 RNA 提取及逆转录，超微量紫外分光光度计检测总 RNA 质量和浓度。取 1 μg 总 RNA 按 PrimeScriptTM RT 试剂盒步骤进行逆转录。根据 SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 试剂盒说明书进行实时 PCR 反应。miR-4287 扩增体系共 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物（10 μmol/L）0.2 μL；扩增程序：95℃ 预变性 10 s；PCR 反应，95℃5 s、60℃20 s，40 个循环。ADAMTS4 mRNA 扩增体系 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL；稀释 cDNA 1.0 μL，无酶水 3 μL。扩增程序：95℃ 预变性 2 min；PCR 反应，95℃5 s、60℃34 s，扩增 40 个循环。引物序列：miR-4287，上游5′-CTTGAGGGCACTTTAAAAAAAAA-3′；U6，上游 5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，下游 5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′；ADAMTS4，上游 5′-TTTCCCTGGCAAGGACTATG-3′，下游 5′-GGAGGAGAACTGGACACCAC-3′；GAPDH，上游 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游 5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。以 U6 或 GAPDH 作为内参基因，采用 2-ΔΔCt相对定量法分析 miR-4287 及 ADAMTS4 mRNA 相对表达量。
1.4.2 Western blot 检测
取收集的软骨细胞，弃培养液，4℃ 预冷 PBS 清洗细胞 3 次，每孔加入 150 μL RIPA 裂解液，在冰上用细胞刮将细胞刮下至离心管中，继续冰上裂解 30 min。以 14 000×g 离心 10 min，收集取上清，用 BSA 法检测蛋白质浓度。蛋白液混合上样缓冲液后煮沸变性，变性蛋白液样品上样至 12%SDS-PAGE，电泳后将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜。5 % 脱脂奶粉封闭 1 h，加入一抗（兔抗鼠 ADAMTS4 抗体、兔抗鼠 GAPDH 抗体）孵育 12 h，TBST 洗涤 3 次，每次 5 min；加入山羊抗兔二抗孵育 2 h，TBST 洗涤 3 次，每次 5 min。加入化学发光液，超灵敏化学发光成像仪采集图像。
1.5 荧光素酶报告实验
将野生型或突变型 ADAMTS4 mRNA 3’ UTR 分别克隆至萤火虫荧光素酶报告载体。分别共转染 miR-4287 模拟物或模拟物阴性对照、野生型或突变型萤火虫荧光素酶报告载体、海肾荧光素酶载体至 293T 工具细胞。共转染 48 h 后裂解细胞，酶标仪检测各组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性比值，验证 miR-4287 是否与 ADAMTS4 mRNA 靶向结合。实验重复 3 次。
1.6 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较组织样本采用 Mann-Whitney 检验，细胞样本采用配对 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析；荧光素酶报告采用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 正常和骨关节炎软骨组织 miR-4287 和 ADAMTS4 表达
miR-4287 在正常和骨关节炎软骨组织中均有表达。骨关节炎软骨组织 miR-4287 相对表达量为 0.490±0.237，较正常软骨组织（1.074±0.507）下降，比较差异有统计学意义（Z=–2.572，P=0.010）。骨关节炎软骨组织 ADAMTS4 mRNA 相对表达量为 19.138±4.520，较正常软骨组织（1.864±1.786）上升，比较差异有统计学意义（Z=–2.611，P=0.009）。
2.2 IL-1β 对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
IL-1β 下调软骨细胞 miR-4287 表达。IL-1β 刺激处理 3、6、12 h 后，骨关节炎软骨细胞 miR-4287 相对表达量分别为 0.680±0.290、0.962±0.277、0.804±0.168，均较对照组（1.010±0.172、1.463±0.215、1.786±0.294）下降，比较差异有统计学意义（t=4.818，P=0.041；t=9.480，P=0.011；t=11.410，P=0.007）；IL-1β 处理组各时间点间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
IL-1β 上调软骨细胞 ADAMTS4 mRNA 表达。IL-1β 刺激处理 3、6、12 h 后，骨关节炎软骨细胞 ADAMTS4 mRNA 相对表达量分别为 3.935±1.554、17.973±4.609、24.032±9.275，均较对照组（1.175±0.660、0.536±0.233、1.746±1.400）升高，比较差异均有统计学意义（t=5.340，P=0.033；t=6.261，P=0.025；t=4.901，P=0.039）。随着 IL-1β 刺激时间延长，ADAMTS4 mRNA 相对表达量逐渐上升，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3 IL-1β 介导的信号通路对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
SP600125 预处理+IL-1β 刺激组及 SN50 预处理+IL-1β 刺激组 miR-4287 相对表达量分别为 1.557±0.266 和 1.772±0.303，较 IL-1β 刺激组（1.002±0.086）升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
SP600125 预处理+IL-1β 刺激组及 SN50 预处理+IL-1β 刺激组 ADAMTS4 mRNA 相对表达量分别为 0.458±0.109 和 0.634±0.168，较 IL-1β 刺激组（1.004±0.114）降低，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 miR-4287 调控软骨细胞 ADAMTS4 表达
转染 48 h 后实时荧光定量 PCR 检测示，miR-4287 模拟物组 ADAMTS4 mRNA 相对表达量为 0.402±0.353，较 miR-4287 模拟物阴性对照组（1.077±0.525）下降，比较差异有统计学意义（t=4.832，P=0.040）；miR-4287 抑制物组 ADAMTS4 mRNA 相对表达量为 3.698±0.900，较 miR-4287 抑制物阴性对照组（1.0435±0.346）升高，比较差异有统计学意义（t=6.397，P=0.024）。
Western blot 检测示，miR-4287 模拟物组 ADAMTS4 蛋白相对表达量为 0.400±0.016，较 miR-4287 模拟物阴性对照组（0.572±0.050）下降，差异有统计学意义（t=5.722，P=0.005）。miR-4287 抑制物组 ADAMTS4 蛋白相对表达量为 1.045±0.040，较 miR-4287 抑制物阴性对照组（0.600±0.024）升高，差异有统计学意义（t=–16.469，P=0.000）。见图 1。
图1
Western blot 检测各组转染后ADAMTS4蛋白表达
1：miR-4287 模拟物阴性对照组；2：miR-4287 模拟物组；3：miR-4287 抑制物阴性对照组；4：miR-4287 抑制物组
Figure1. Expression of ADAMTS4 protein by Western blot after transfection1: miR-4287 mimics negative control group; 2: miR-4287 mimics group; 3: miR-4287 inhibitors negative control group; 4: miR-4287 inhibitors group
2.5 验证 miR-4287 与 ADAMTS4 mRNA 靶向结合
报告载体携带野生型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 时，miR-4287 模拟物阴性对照组双萤光素酶活性比值为 1.000±0.113，miR-4287 模拟物组为 0.982±0.085，比较差异无统计学意义（t=0.318，P=0.757）。报告载体携带突变型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 时，miR-4287 模拟物阴性对照组双萤光素酶活性比值为 1.000±0.046，miR-4287 模拟物组为 0.970±0.085，比较差异无统计学意义（t=0.768，P=0.460）。见图 2。
图2
荧光素酶报告实验验证 miR-4287 与 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 结合
Figure2.
Validation the direct interaction of miR-4287 and ADAMTS4 mRNA 3’UTR by luciferase reporter assay
3 讨论
miRNA 是一类内源性非编码蛋白的小 RNA 分子，大小为 19～25 个核苷酸，普遍存在于植物和动物基因组中。miRNA 作用方式较为明确，主要通过与目的基因 mRNA 分子的 3’UTR 互补结合，导致靶基因 mRNA 裂解或抑制其翻译，从而在转录后水平沉默目的基因 mRNA [9]。随着对 miRNA 研究的不断加深，人们逐渐认识到 miRNA 在细胞分化、细胞周期以及凋亡等过程中具有重要作用[10]。众多证据表明 miRNA 也参与了软骨细胞的分化、增殖及凋亡等过程，因此与软骨形成、骨关节炎发生发展息息相关[11-12]。成软骨相关 miRNA 往往也在骨关节炎疾病进程中扮演着重要角色。据报道，miR-320c[5]、miR-455-3p[6]、miR-92a-3p[7]与成软骨分化密切相关，同时也能负性调控软骨细胞外基质代谢相关基因 MMP-13、HDAC2 表达，从而减缓软骨细胞基质降解、退变。
目前对 miR-4287 的研究主要见于高通量芯片筛选出的疾病相关 miRNA 表达谱[13-15]，尚无 miR-4287 功能鉴定文献报道。我们前期研究发现，miR-4287 在成软骨分化过程中差异表达，推测其可能与软骨退变相关，本次研究旨在初步探索 miR-4287 在人软骨退变中的作用。结果表明，miR-4287 骨关节炎软骨组织和软骨细胞炎症模型中表达均降低，提示 miR-4287 可能是一种与软骨退变相关的 miRNA。
致炎因子 IL-1β 介导的软骨退变相关基因表达、软骨细胞外基质降解主要依赖 MAPK 信号通路和 NF-κB 信号通路转导[3, 16]。据报道，MAPK 信号通路和 NF-κB 信号通路也可参与软骨细胞内 miRNA（如 miR-558、miR-127-5p）的表达调控，而 IL-1β 诱导的 miR-558、miR-127-5p 表达下降作用可被上述通路抑制剂所拮抗[17-18]。本研究中，阻断 MAPK 通路和 NF-κB 信号通路能抵消 IL-1β 对 miR-4287 表达的抑制效应，说明 IL-1β 介导的下游信号通路在 miR-4287 表达调控中具有重要作用。
miRNA 是一种调节软骨细胞外代谢的重要因素[19]。据报道，miR-127-5p 在骨关节炎软骨组织中下调，体外实验证实 miR-127-5p 可直接与 MMP-13 mRNA 结合，抑制 IL-1β 诱导的 MMP-13 表达，从而减缓 Ⅱ 型胶原降解[18]。miR-125b 也可与 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 特定位点结合，从而抑制后者对聚蛋白多糖的降解[20]。通过查阅 TargerScan miRNAs 靶基因预测工具，我们发现 ADAMTS4 3’UTR 中存在能与 miR-4287 匹配的序列。转染实验表明，miR-4287 对 ADAMTS4 表达有明显的抑制效应。而用 siRNA 抑制 miR-4287 功能，上述抑制效应又可被抵消。因此，我们推测 ADAMTS4 可能是 miR-4287 的靶基因。然而荧光素酶实验结果显示，无论该预测结合位点为野生型或突变型，miR-4287 均不能改变与其串联表达的荧光素酶活性。上述结果提示，虽然 miR-4287 能下调 ADAMTS4 表达，但 ADAMTS4 并不是 miR-4287 的靶基因，其对 ADAMTS4 的表达调控并不是通过与 3’UTR 直接结合的方式发挥作用。
综上述，本研究初步表明，成软骨相关 miR-4287 能调控软骨细胞 ADAMTS4 表达，是一种与软骨退变密切相关的 miRNA。然而本研究并未能揭示 miR-4287 调控软骨细胞 ADAMTS4 表达的具体机制。据报道，miRNAs 也可通过其他方式间接调控软骨 ADAMTS4 表达。有研究证实，ADAMTS4 是转录因子 RUNX2 潜在的下游靶标，miR-105 通过抑制 RUNX2 的表达和功能，进而调节 ADAMTS4 表达[21]。HMGB1 是 NF-κB 信号通路的激活剂，miR-142-3p 可靶向抑制 HMGB1 功能，从而抑制 NF-κB 信号通路介导的软骨细胞凋亡及炎性介质产生[22]。靶基因预测工具提示 RUNX2 和 HMGB1 mRNA 3’UTR 存在 miR-4287 结合位点，miR-4287 对于 ADAMTS4 的调控作用可能是通过 RUNX2 或 HMGB1 等分子来实现的。miR-4287 对 ADAMTS4 的调控是否通过上述两种途径发挥作用，还有待进一步研究。
软骨细胞外基质是关节软骨的重要组成部分，其进行性丢失是关节软骨退变的特征性改变[1]。软骨细胞外基质代谢包括合成代谢和分解代谢，正常软骨组织中两者处于动态平衡，而骨关节炎软骨组织中分解代谢占优势。聚蛋白多糖酶-1 是软骨细胞外基质分解代谢的重要酶类，属于带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族，即 ADAMTS4。ADAMTS4 具有切割、水解作用，广泛参与软骨细胞外基质聚蛋白多糖降解[2]。近年来研究发现，miRNA 在骨关节炎软骨细胞外基质代谢中扮演着重要角色[3]。miRNA 通过负性调控软骨细胞外基质代谢相关基因表达，从而稳定或打破软骨基质代谢内环境平衡[4]。miR-320、miR-455-3p、miR-92a 等在软骨形成过程中具有重要作用，同时这些与软骨形成相关的 miRNA 也参与了骨关节炎软骨细胞外基质代谢调控[5-8]。
本课题组前期研究结果表明，miR-4287 在脂肪干细胞诱导成软骨过程中发生了差异性表达，提示其与软骨形成密切相关[8]，但目前 miR-4287 在软骨细胞外基质代谢中的作用尚未见报道。生物信息学提示 ADAMTS4 mRNA 3’ 非翻译区（untranslated region，UTR）存在 miR-4287 结合位点。因此，我们推测 miR-4287 可能以直接结合方式抑制软骨细胞 ADAMTS4 表达。本研究应用 IL-1β 处理软骨细胞，诱导炎症模型产生，通过实时荧光定量 PCR 检测 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达；并进一步转染 miR-4287 模拟物和抑制物，探讨 miR-4287 对软骨细胞 ADAMTS4 的调控作用及机制。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验标本
膝关节软骨组织取自 2016 年 8 月—2017 年 1 月于中山大学附属第一医院关节外科或骨肿瘤科住院患者，取材经过中山大学附属第一医院伦理委员会批准以及患者及家属知情同意。其中，正常软骨取自 10 例行截肢术或保肢-肿瘤型膝关节假体置换术患者的股骨髁、胫骨平台；男 7 例，女 3 例；年龄 12～50 岁，平均 23.5 岁。骨关节炎软骨取自 23 例因骨关节炎行人工全膝关节置换术患者的股骨髁、胫骨平台；男 7 例，女 15 例；年龄 50～81 岁，平均 69.9 岁。
1.2 主要试剂及仪器
IL-1β（PeproTech 公司，美国）；胶原酶（Sigma 公司，美国）；MAPK 信号通路抑制剂 SP600125、NF-κB 信号通路抑制剂 SN50（Calbiochem 公司，美国）；miR-4287 模拟物及其阴性对照、miR-4287 抑制物及其阴性对照（广州锐博生物材料有限公司）；转染试剂 Lipofectamine® 2000、优化培养基 OPTI-MEM（Life Technologies 公司，美国）；兔抗鼠 ADAMTS4 抗体、兔抗鼠 GAPDH 抗体（Millipore 公司，美国）；RIPA 裂解液、丝氨酸蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白定量试剂盒、山羊抗兔二抗（北京康为世纪生物科技有限公司）；荧光素酶报告载体构建由上海和元生物技术有限公司完成。
CO2 恒温培养箱（Thermo Forma 公司，美国）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；倒置相差显微镜（Thermo Shandn 公司，美国）；低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；超微量紫外分光光度计（BioTek 公司，美国）；普通梯度 PCR 仪（BIAMETRA 公司，德国）；实时荧光定量 PCR 系统 ABI ViiATM7Dx（Applied Biosystems 公司，美国）；超灵敏化学发光成像仪（GE 公司，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 软骨细胞分离培养
无菌条件下，将正常及骨关节炎软骨组织分别置于 10 cm 培养皿中，尽量剪碎软骨组织，并称重。PBS 清洗后加入 0.25% 胰蛋白酶，于 37℃ 培养箱中振荡消化 30 min，弃上清，PBS 清洗 3 次；加入 1 ng/mL 胶原酶，于 37℃ 培养箱中振荡消化 4～6 h，用 70 μm 细胞滤网过滤，1 500×g 离心 5 min，收集细胞。将正常及骨关节炎软骨细胞分别接种于 25 cm2或 75 cm2培养瓶中，置于 37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养，隔天换液 1 次，取第 1 代细胞用于后续实验。
1.3.2 正常及骨关节炎软骨组织中 miR-4287 和 ADAMTS4 表达情况
取正常及骨关节炎软骨组织，尽量剪碎后并置于研磨皿中。加入液氮，快速研磨后加入适量 Trizol 试剂，总 RNA 抽提后使用实时荧光定量 PCR 检测组织内 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达量。
1.3.3 IL-1β 对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
将生长状态良好的骨关节炎软骨细胞按 3×105个/孔接种于 12 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养，24 h 后更换含 5 ng/mL IL-1β 的无血清培养基继续培养。分别于培养 3、6、12 h 收集 2～3 孔细胞，采用实时荧光定量 PCR 检测 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达量。以正常培养 3、6、12 h 的骨关节炎软骨细胞作为对照组。实验重复 3 次。
1.3.4 IL-1β 介导的信号通路对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
取骨关节炎软骨细胞，按 1×105个/孔接种于 24 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5%CO2 恒温培养箱中培养。24 h 后分别给予 10 μmol/L MAPK 信号通路抑制剂 SP600125 以及 5 μmol/L NF-κB 信号通路抑制剂 SN50，预处理 2 h；然后加入 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h，取细胞采用实时荧光定量 PCR 检测 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表达量。以单纯 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h 处理的骨关节炎软骨细胞作为对照。实验重复 3 次。
1.3.5 miR-4287 调控软骨细胞 ADAMTS4 表达观察
取骨关节炎软骨细胞，按 3×105个/孔接种于 12 孔板，加入不含抗生素的培养基培养 24 h 后，将细胞随机分为 4 组，参照 Lipofectamine® 2000 说明书，分别采用 50 μmol/L miR-4287 模拟物和阴性对照模拟物、100 μmol/L miR-4287 抑制物和阴性对照抑制物进行转染。转染 48 h 后收集各组细胞，采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 检测 ADAMTS4 mRNA 及蛋白表达量。
1.4 检测方法
1.4.1 实时荧光定量 PCR 检测
取收集的软骨细胞进行总 RNA 提取及逆转录，超微量紫外分光光度计检测总 RNA 质量和浓度。取 1 μg 总 RNA 按 PrimeScriptTM RT 试剂盒步骤进行逆转录。根据 SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 试剂盒说明书进行实时 PCR 反应。miR-4287 扩增体系共 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物（10 μmol/L）0.2 μL；扩增程序：95℃ 预变性 10 s；PCR 反应，95℃5 s、60℃20 s，40 个循环。ADAMTS4 mRNA 扩增体系 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL；稀释 cDNA 1.0 μL，无酶水 3 μL。扩增程序：95℃ 预变性 2 min；PCR 反应，95℃5 s、60℃34 s，扩增 40 个循环。引物序列：miR-4287，上游5′-CTTGAGGGCACTTTAAAAAAAAA-3′；U6，上游 5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，下游 5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′；ADAMTS4，上游 5′-TTTCCCTGGCAAGGACTATG-3′，下游 5′-GGAGGAGAACTGGACACCAC-3′；GAPDH，上游 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游 5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。以 U6 或 GAPDH 作为内参基因，采用 2-ΔΔCt相对定量法分析 miR-4287 及 ADAMTS4 mRNA 相对表达量。
1.4.2 Western blot 检测
取收集的软骨细胞，弃培养液，4℃ 预冷 PBS 清洗细胞 3 次，每孔加入 150 μL RIPA 裂解液，在冰上用细胞刮将细胞刮下至离心管中，继续冰上裂解 30 min。以 14 000×g 离心 10 min，收集取上清，用 BSA 法检测蛋白质浓度。蛋白液混合上样缓冲液后煮沸变性，变性蛋白液样品上样至 12%SDS-PAGE，电泳后将蛋白转印至聚偏氟乙烯膜。5 % 脱脂奶粉封闭 1 h，加入一抗（兔抗鼠 ADAMTS4 抗体、兔抗鼠 GAPDH 抗体）孵育 12 h，TBST 洗涤 3 次，每次 5 min；加入山羊抗兔二抗孵育 2 h，TBST 洗涤 3 次，每次 5 min。加入化学发光液，超灵敏化学发光成像仪采集图像。
1.5 荧光素酶报告实验
将野生型或突变型 ADAMTS4 mRNA 3’ UTR 分别克隆至萤火虫荧光素酶报告载体。分别共转染 miR-4287 模拟物或模拟物阴性对照、野生型或突变型萤火虫荧光素酶报告载体、海肾荧光素酶载体至 293T 工具细胞。共转染 48 h 后裂解细胞，酶标仪检测各组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性比值，验证 miR-4287 是否与 ADAMTS4 mRNA 靶向结合。实验重复 3 次。
1.6 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较组织样本采用 Mann-Whitney 检验，细胞样本采用配对 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析；荧光素酶报告采用独立样本 t 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 正常和骨关节炎软骨组织 miR-4287 和 ADAMTS4 表达
miR-4287 在正常和骨关节炎软骨组织中均有表达。骨关节炎软骨组织 miR-4287 相对表达量为 0.490±0.237，较正常软骨组织（1.074±0.507）下降，比较差异有统计学意义（Z=–2.572，P=0.010）。骨关节炎软骨组织 ADAMTS4 mRNA 相对表达量为 19.138±4.520，较正常软骨组织（1.864±1.786）上升，比较差异有统计学意义（Z=–2.611，P=0.009）。
2.2 IL-1β 对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
IL-1β 下调软骨细胞 miR-4287 表达。IL-1β 刺激处理 3、6、12 h 后，骨关节炎软骨细胞 miR-4287 相对表达量分别为 0.680±0.290、0.962±0.277、0.804±0.168，均较对照组（1.010±0.172、1.463±0.215、1.786±0.294）下降，比较差异有统计学意义（t=4.818，P=0.041；t=9.480，P=0.011；t=11.410，P=0.007）；IL-1β 处理组各时间点间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
IL-1β 上调软骨细胞 ADAMTS4 mRNA 表达。IL-1β 刺激处理 3、6、12 h 后，骨关节炎软骨细胞 ADAMTS4 mRNA 相对表达量分别为 3.935±1.554、17.973±4.609、24.032±9.275，均较对照组（1.175±0.660、0.536±0.233、1.746±1.400）升高，比较差异均有统计学意义（t=5.340，P=0.033；t=6.261，P=0.025；t=4.901，P=0.039）。随着 IL-1β 刺激时间延长，ADAMTS4 mRNA 相对表达量逐渐上升，各时间点间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3 IL-1β 介导的信号通路对软骨细胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表达的影响
SP600125 预处理+IL-1β 刺激组及 SN50 预处理+IL-1β 刺激组 miR-4287 相对表达量分别为 1.557±0.266 和 1.772±0.303，较 IL-1β 刺激组（1.002±0.086）升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
SP600125 预处理+IL-1β 刺激组及 SN50 预处理+IL-1β 刺激组 ADAMTS4 mRNA 相对表达量分别为 0.458±0.109 和 0.634±0.168，较 IL-1β 刺激组（1.004±0.114）降低，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 miR-4287 调控软骨细胞 ADAMTS4 表达
转染 48 h 后实时荧光定量 PCR 检测示，miR-4287 模拟物组 ADAMTS4 mRNA 相对表达量为 0.402±0.353，较 miR-4287 模拟物阴性对照组（1.077±0.525）下降，比较差异有统计学意义（t=4.832，P=0.040）；miR-4287 抑制物组 ADAMTS4 mRNA 相对表达量为 3.698±0.900，较 miR-4287 抑制物阴性对照组（1.0435±0.346）升高，比较差异有统计学意义（t=6.397，P=0.024）。
Western blot 检测示，miR-4287 模拟物组 ADAMTS4 蛋白相对表达量为 0.400±0.016，较 miR-4287 模拟物阴性对照组（0.572±0.050）下降，差异有统计学意义（t=5.722，P=0.005）。miR-4287 抑制物组 ADAMTS4 蛋白相对表达量为 1.045±0.040，较 miR-4287 抑制物阴性对照组（0.600±0.024）升高，差异有统计学意义（t=–16.469，P=0.000）。见图 1。
图1
Western blot 检测各组转染后ADAMTS4蛋白表达
1：miR-4287 模拟物阴性对照组；2：miR-4287 模拟物组；3：miR-4287 抑制物阴性对照组；4：miR-4287 抑制物组
Figure1. Expression of ADAMTS4 protein by Western blot after transfection1: miR-4287 mimics negative control group; 2: miR-4287 mimics group; 3: miR-4287 inhibitors negative control group; 4: miR-4287 inhibitors group
2.5 验证 miR-4287 与 ADAMTS4 mRNA 靶向结合
报告载体携带野生型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 时，miR-4287 模拟物阴性对照组双萤光素酶活性比值为 1.000±0.113，miR-4287 模拟物组为 0.982±0.085，比较差异无统计学意义（t=0.318，P=0.757）。报告载体携带突变型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 时，miR-4287 模拟物阴性对照组双萤光素酶活性比值为 1.000±0.046，miR-4287 模拟物组为 0.970±0.085，比较差异无统计学意义（t=0.768，P=0.460）。见图 2。
图2
荧光素酶报告实验验证 miR-4287 与 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 结合
Figure2.
Validation the direct interaction of miR-4287 and ADAMTS4 mRNA 3’UTR by luciferase reporter assay
3 讨论
miRNA 是一类内源性非编码蛋白的小 RNA 分子，大小为 19～25 个核苷酸，普遍存在于植物和动物基因组中。miRNA 作用方式较为明确，主要通过与目的基因 mRNA 分子的 3’UTR 互补结合，导致靶基因 mRNA 裂解或抑制其翻译，从而在转录后水平沉默目的基因 mRNA [9]。随着对 miRNA 研究的不断加深，人们逐渐认识到 miRNA 在细胞分化、细胞周期以及凋亡等过程中具有重要作用[10]。众多证据表明 miRNA 也参与了软骨细胞的分化、增殖及凋亡等过程，因此与软骨形成、骨关节炎发生发展息息相关[11-12]。成软骨相关 miRNA 往往也在骨关节炎疾病进程中扮演着重要角色。据报道，miR-320c[5]、miR-455-3p[6]、miR-92a-3p[7]与成软骨分化密切相关，同时也能负性调控软骨细胞外基质代谢相关基因 MMP-13、HDAC2 表达，从而减缓软骨细胞基质降解、退变。
目前对 miR-4287 的研究主要见于高通量芯片筛选出的疾病相关 miRNA 表达谱[13-15]，尚无 miR-4287 功能鉴定文献报道。我们前期研究发现，miR-4287 在成软骨分化过程中差异表达，推测其可能与软骨退变相关，本次研究旨在初步探索 miR-4287 在人软骨退变中的作用。结果表明，miR-4287 骨关节炎软骨组织和软骨细胞炎症模型中表达均降低，提示 miR-4287 可能是一种与软骨退变相关的 miRNA。
致炎因子 IL-1β 介导的软骨退变相关基因表达、软骨细胞外基质降解主要依赖 MAPK 信号通路和 NF-κB 信号通路转导[3, 16]。据报道，MAPK 信号通路和 NF-κB 信号通路也可参与软骨细胞内 miRNA（如 miR-558、miR-127-5p）的表达调控，而 IL-1β 诱导的 miR-558、miR-127-5p 表达下降作用可被上述通路抑制剂所拮抗[17-18]。本研究中，阻断 MAPK 通路和 NF-κB 信号通路能抵消 IL-1β 对 miR-4287 表达的抑制效应，说明 IL-1β 介导的下游信号通路在 miR-4287 表达调控中具有重要作用。
miRNA 是一种调节软骨细胞外代谢的重要因素[19]。据报道，miR-127-5p 在骨关节炎软骨组织中下调，体外实验证实 miR-127-5p 可直接与 MMP-13 mRNA 结合，抑制 IL-1β 诱导的 MMP-13 表达，从而减缓 Ⅱ 型胶原降解[18]。miR-125b 也可与 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 特定位点结合，从而抑制后者对聚蛋白多糖的降解[20]。通过查阅 TargerScan miRNAs 靶基因预测工具，我们发现 ADAMTS4 3’UTR 中存在能与 miR-4287 匹配的序列。转染实验表明，miR-4287 对 ADAMTS4 表达有明显的抑制效应。而用 siRNA 抑制 miR-4287 功能，上述抑制效应又可被抵消。因此，我们推测 ADAMTS4 可能是 miR-4287 的靶基因。然而荧光素酶实验结果显示，无论该预测结合位点为野生型或突变型，miR-4287 均不能改变与其串联表达的荧光素酶活性。上述结果提示，虽然 miR-4287 能下调 ADAMTS4 表达，但 ADAMTS4 并不是 miR-4287 的靶基因，其对 ADAMTS4 的表达调控并不是通过与 3’UTR 直接结合的方式发挥作用。
综上述，本研究初步表明，成软骨相关 miR-4287 能调控软骨细胞 ADAMTS4 表达，是一种与软骨退变密切相关的 miRNA。然而本研究并未能揭示 miR-4287 调控软骨细胞 ADAMTS4 表达的具体机制。据报道，miRNAs 也可通过其他方式间接调控软骨 ADAMTS4 表达。有研究证实，ADAMTS4 是转录因子 RUNX2 潜在的下游靶标，miR-105 通过抑制 RUNX2 的表达和功能，进而调节 ADAMTS4 表达[21]。HMGB1 是 NF-κB 信号通路的激活剂，miR-142-3p 可靶向抑制 HMGB1 功能，从而抑制 NF-κB 信号通路介导的软骨细胞凋亡及炎性介质产生[22]。靶基因预测工具提示 RUNX2 和 HMGB1 mRNA 3’UTR 存在 miR-4287 结合位点，miR-4287 对于 ADAMTS4 的调控作用可能是通过 RUNX2 或 HMGB1 等分子来实现的。miR-4287 对 ADAMTS4 的调控是否通过上述两种途径发挥作用，还有待进一步研究。
