经颅磁刺激（TMS）作为一种无创的神经调控技术现已用于神经和精神类疾病的临床治疗，但不同频率与模式TMS的刺激效果及其神经调控机制尚未明确。本文从神经电生理角度探究不同频率重复TMS（rTMS）和短阵快速脉冲TMS（bTMS）对小鼠学习记忆和神经元兴奋性的影响。本文实验采用8周的昆明小鼠42只，随机分为伪刺激组和刺激组；刺激组包括：不同频率（1、5、10 Hz）的 rTMS刺激组；不同频率（1、5、10 Hz）的bTMS刺激组。其中，刺激组接受连续14 d的刺激。刺激结束后，小鼠进行新物体识别与跳台实验以检测小鼠记忆能力；随后进行脑片膜片钳实验分析小鼠海马齿状回（DG）颗粒细胞兴奋性。结果表明，与伪刺激组相比，高频（5、10 Hz）的rTMS与bTMS能提高小鼠记忆能力和神经元兴奋性，而低频（1 Hz）的rTMS与bTMS则无显著效果；同频率下两种刺激模式对小鼠记忆功能与神经元兴奋性的影响无明显差别。本文研究结果提示，高频TMS可通过提高海马DG颗粒神经元兴奋性来提高小鼠记忆功能。本文为TMS改善认知功能的机制研究和临床应用提供实验和理论依据。
引用本文： 付蕊, 朱海军, 丁冲, 徐桂芝. 不同频率重复脉冲与短阵快速脉冲经颅磁刺激对小鼠记忆功能和神经元兴奋性影响的对比分析. 生物医学工程学杂志, 2024, 41(5): 935-944. doi: 10.7507/1001-5515.202312017 复制
0 引言
经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是Barker等[1]在1985年提出的作为间接、非侵入的神经调控技术，并于2008年经美国食品药品监督管理局批准，用于治疗重度抑郁症[2]。目前，TMS技术已在疾病诊断及治疗中展现出一定潜力。除抑郁症外，也尝试将TMS用于治疗焦虑症、阿尔茨海默病、帕金森病、血管性认知障碍、卒中后运动功能损伤等[3-6]。TMS可以诱导大脑活动变化，已成为研究人脑生理和行为关系的有力工具[7]。此外，TMS还可以与脑电图相结合，评估电磁感应对皮层振荡的影响[8]。
TMS的治疗效果取决于刺激的频率、脉冲数、强度、时长和潜在的大脑皮层活动状态[9-12]。其中，刺激频率被认为是决定刺激后效果的主要因素之一[13]。一般来说，较低频率（1 ≤ f < 5 Hz）的重复TMS（repetitive TMS，rTMS）会抑制皮层兴奋性；而较高频率（f ≥ 5 Hz，一般在5～25 Hz之间）的rTMS会增加皮质兴奋性[13-15]。即，低频rTMS抑制作用优于促进作用，而高频rTMS促进作用优于抑制作用[7]。但也有研究者在rTMS对皮质脊髓兴奋性影响的研究中发现，10 Hz组在该研究的全部疗程中均未发现明显变化[16]。θ短阵快速脉冲刺激（theta burst stimulation，TBS）与rTMS相较，能在较低的刺激强度和较短的刺激时间内产生强大而持久的效果[11, 17]。经典的TBS刺激模仿脑电发放的θ和γ节律，由γ频段3个50 Hz的高频短阵脉冲耦合5 Hz的θ频段节律组成，即3个50 Hz的高频短阵脉冲每200 ms发出一次[12, 14, 18]。短阵快速脉冲TMS（burst TMS，bTMS）是参考TBS模式后更改丛间频率而来，其中5 Hz的bTMS与标准TBS模式一致。目前，刺激频率与模式各异导致TMS改善认知功能的效果并不一致，且多从单一角度分析，很少有不同频率与模式的共同分析报道。基于此，本研究旨在研究不同频率与模式的TMS对小鼠学习记忆能力及海马齿状回（dentate gyrus，DG）颗粒神经元兴奋性的影响，以期从神经元兴奋性角度理解TMS改善认知功能的机制，为临床应用提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验设计
本研究对8周龄的昆明小鼠进行随机分组后，开展为期两周的刺激和伪刺激（sham）实验，采用新物体识别和跳台实验检测小鼠学习记忆能力，随后进行脑片膜片钳实验检测其神经元兴奋性，具体实验流程如图1所示。
图1
实验流程图
Figure1.
Experimental flowchart
1.2 实验动物和分组
本研究所有实验过程符合实验动物的使用准则，符合河北省动物实验开展要求，已通过河北工业大学动物伦理委员会的审批（批文编号：HEBUTacuc2022028）。实验所用动物购自华阜康生物科技有限公司；将8周龄昆明小鼠随机分成sham组和6种不同刺激方式的刺激组，共7组，每组6只。
（1）sham组：线圈垂直放置远离小鼠头部，小鼠只听到刺激声音，不接受TMS；
（2）1 Hz rTMS组：施加频率为1 Hz的rTMS，共60串脉冲，串持续时间为10 s，串间隔为10 s；
（3）5 Hz rTMS组：施加频率为5 Hz的rTMS，共20串脉冲，串持续时间为6 s，串间隔为10 s；
（4）10 Hz rTMS组：施加频率为10 Hz的rTMS，共20串脉冲，串持续时间为3 s，串间隔为10 s；
（5）1 Hz bTMS组：施加频率为1 Hz的bTMS，共20串脉冲，串持续时间为10 s，串间隔为10 s，串内脉冲均由3个50 Hz短阵快速脉冲组成；
（6）5 Hz bTMS组：施加频率为5 Hz的bTMS，共20串脉冲，串持续时间为2 s，串间隔为10 s，串内脉冲均由3个50 Hz短阵快速脉冲组成；
（7）10 Hz bTMS组：施加频率为10 Hz的bTMS，共20串脉冲，串持续时间为1 s，串间隔为10 s，串内脉冲均由3个50 Hz短阵快速脉冲组成。
1.3 经颅磁刺激
TMS设备采用重复脉冲磁刺激仪Rapid2（Magstim，英国），线圈采用标准八字形线圈D70 P/N9925-00（Magstim，英国），线圈输出的最大磁场强度为2.2 T。刺激组的刺激强度为15%线圈输出最大强度（约为0.3 T），每天进行600个脉冲刺激，连续进行14 d，刺激模式分别为rTMS和bTMS，频率分别为1、5、10 Hz。TMS方案如附图1所示。
1.4 新物体识别实验
新物体识别实验共分为四个阶段，分别是空箱适应期、物体熟悉期、测试Ⅰ期以及测试Ⅱ期；实验流程如附图2所示。在测试I期与测试II期录制视频用于分析，小鼠鼻尖触碰物体视为对物体的探索行为，分析小鼠在测试Ⅰ、Ⅱ期的认知指数来评估小鼠的空间学习记忆能力，认知指数由探索新物体时间除以探索新旧物体总时间计算所得。
图2
动作电位示意图
Figure2.
Schematic diagram of the action potential
1.5 跳台实验
跳台实验共分为四个阶段，分别是适应期、适应测试期、电刺激期以及被动逃避期；整个实验过程中，箱体内均有灯光光照；且在电刺激期以及被动逃避期，对跳台底部栅极施加幅值为28 V的电压；实验流程如附图3所示。适应测试期，小鼠首次跳下台子的时间记为适应潜伏期；电刺激期，从小鼠受到电击跳上台子开始计时，小鼠跳下跳台的次数记为错误次数；被动逃避期，小鼠首次跳下台子的时间记为逃避潜伏期，小鼠跳下的次数记为错误次数。
图3
新物体识别认知指数
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1.6 急性海马脑片制备
小鼠在麻醉状态下快速断头取脑，并将小鼠脑组织置于冰水混合且氧饱和的切片液中。使用振动切片机在大脑冠状平面上切取7～8片含有海马脑区的300 μm厚度的脑片。将脑片置于装有30 °C且氧饱和的人工脑脊液中，孵育1 h备用。溶液成分参考文献[19]所述，如附表1所示。
1.7 脑片膜片钳实验
采用全细胞记录模式，选取海马DG区颗粒细胞为目标细胞，目标细胞与充灌有电极内液的玻璃微电极形成高阻封接，细胞抽吸破膜后记录10 s内的电位值记为细胞的静息膜电位。选取静息膜电位在−70 mV左右的细胞，记录细胞在100、150、200 pA电流钳制下，500 ms内所诱发的动作电位个数，进行动作电位诱发频率分析。记录细胞在150 pA电流钳制下所诱发的单个动作电位，做动作电位动力学分析；动作电位特征包括阈值电位、阈值电位减后电位、达峰时间（指细胞从静息电位到达峰值电位的时间）、半波宽，以及上升支和下降支平均斜率，如图2所示。每只小鼠选取2个细胞信号，所有初始数据在多通道数据采集软件PatchMaster（HEKA，德国）上记录。电极内液成分参考文献[19]所述，如附表1所示。
1.8 数据统计分析
所有数据均以均值
标准误的形式表示，刺激组与sham组对比采用单因素方差方法进行统计分析，不同模式刺激组之间采用双因素方差方法进行统计分析，检验标准为0.05，事后分析采用图基多重比较。
2 结果
2.1 新物体识别实验结果
如图3所示为新物体识别实验认知指数分析，刺激频率在测试Ⅰ期认知指数［rTMS：F（3，20） = 4.49，P =
2.2 跳台实验结果
如图4所示为跳台实验结果分析，各组小鼠的适应潜伏期差异无统计学意义，双因素方差分析中，刺激频率与刺激模式主效应没有统计学意义。在电刺激期错误次数分析中，刺激频率［rTMS：F（3，20） = 12.15，P < 0.01；bTMS：F（3，20） = 17.34，P < 0.01］主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及1、5、10 Hz的bTMS组，与sham组的错误次数差异有统计学意义；均少于sham组的错误次数［（7.3 ± 1.05）次］；双因素方差分析中，刺激频率［F（2，30） = 15.9，P < 0.01］和刺激模式［F（1，30） = 4.783，P =
图4
跳台实验结果分析
*
*
2.3 电生理实验结果
2.3.1 不同电流钳制下动作电位频率分析
如图5所示为神经元动作电位频率分析，在100 pA［rTMS：F（3，44） = 61.03，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 60.13，P < 0.01］、150 pA［rTMS：F（3，44） = 43.6，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 49.03，P < 0.01］和200 pA［rTMS：F（3，44） = 29.26，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 37.49，P < 0.01］下刺激频率主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及5、10 Hz的bTMS组，与sham组的动作电位频率差异有统计学意义，均高于sham组动作电位频率［100 pA：（2.5 ± 0.78）Hz；150 pA：（9.5 ± 1.65）Hz；200 pA：（17.7 ± 1.44）Hz］。双因素方差分析中，刺激频率［100 pA：F（2，66） = 99.93，P < 0.01；150 pA：F（2，66） = 86.84，P < 0.01；200 pA：F（2，66） = 59.08，P < 0.01］主效应有统计学意义，刺激模式主效应没有统计学意义，二者不存在交互效应。
图5
动作电位频率分析
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2.3.2 动作电位动力学分析
如图6所示为神经元动作电位特征分析，刺激频率在动作电位的阈值电位［rTMS：F（3，44） = 64.3，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 56.9，P < 0.01］、阈值电位减后电位［rTMS：F（3，44） = 30.11，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 37.06，P < 0.01］、达峰时间［rTMS：F（3，44） = 73.44，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 33.63，P < 0.01］和半波宽［rTMS：F（3，44） = 25.96，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 19.3，P < 0.01］中主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及5、10 Hz的bTMS组，与sham组的差异有统计学意义，较sham组阈值电位［（−25.9 ± 1.22）mV］向静息电位方向移动；较sham组阈值电位减后电位［（17.7 ± 0.32）mV］减小，意味更加接近阈值电位，更利于产生动作电位；较sham组达峰时间［（5.4 ± 0.15） ms］缩短，较sham组半波宽［（2.1 ± 0.05）ms］减小。在双因素方差分析中，刺激频率在阈值电位［F（2，66） = 120.3，P < 0.01］、阈值电位减后电位［F（2，66） = 26.14，P < 0.01］、达峰时间［F（2，66） = 60.74，P < 0.01］和半波宽［F（2，66） = 56.8，P < 0.01］主效应有统计学意义，刺激模式主效应没有统计学意义。刺激频率与刺激模式仅在阈值电位中存在交互效应［F（2，66） = 5.663，P < 0.01］；事后分析表明，1 Hz的bTMS组阈值电位［（−32.6 ± 0.28）mV］较1 Hz的rTMS组阈值电位［（−29.3 ± 0.50）mV］向静息电位方向移动；其余指标中刺激频率与刺激模式不存在交互效应。
图6
动作电位特征分析
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如图7所示为神经元动作电位斜率分析，刺激频率在上升支平均斜率［rTMS：F（3，44） = 62.38，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 43.14，P < 0.01］与下降支平均斜率［rTMS：F（3，44） = 130，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 58.56，P < 0.01］中主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及1、5、10 Hz的bTMS组，与sham组的动作电位上升支平均斜率、下降支平均斜率差异有统计学意义，较sham组上升支平均斜率［（32.9 ± 0.60）mV/ms］与下降支平均斜率［（−23.6 ± 0.78）mV/ms］增加。双因素方差分析中，刺激频率在上升支平均斜率［F（2，66） = 67.3，P < 0.01］、下降支平均斜率［F（2，66） = 209.9，P < 0.01］中主效应有统计学意义，刺激模式主效应没有统计学意义，刺激频率与刺激模式在下降支平均斜率中存在交互效应［F（2，66） = 10.24，P < 0.01］。事后分析表明，1 Hz的bTMS组下降支平均斜率［（−26.8 ± 0.32）mV/ms］较1 Hz的rTMS组［（−24.6 ± 0.40）mV/ms］增加。
图7
动作电位斜率分析
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3 讨论
本文通过新物体识别及跳台实验，探究不同频率和模式的TMS对小鼠记忆功能的影响；并通过脑片膜片钳实验采集小鼠海马DG区颗粒神经元的动作电位，通过分析动作电位诱发频率、达峰时间、阈值电位、半波宽等相关特征探究TMS影响小鼠记忆功能的神经电生理机制。结果表明，高频（5、10 Hz）的rTMS与bTMS均可提高小鼠记忆能力和神经元兴奋性，提示高频TMS可通过提高海马DG区颗粒神经元兴奋性来提高小鼠记忆功能。
新物体识别和跳台实验是经典的啮齿类动物学习记忆认知功能实验。在新物体识别中进行了短期和长期的空间记忆相关任务，结果显示经高频（5、10 Hz）的TMS后小鼠空间记忆相关认知能力有所提升。对比同一组别的测试Ⅰ期与测试Ⅱ期的认知指数，测试Ⅰ期认知指数均略高于测试Ⅱ期。已有研究表明，高频TMS可以修复八齿鼠经睡眠剥夺后在新物体识别任务中认知功能的损伤[20-21]；20 Hz高频rTMS可以修复老年小鼠在老化过程中的认知损伤[19]；与本研究结论一致。
跳台实验结果表明，在未受电刺激训练的适应测试期中，各组小鼠适应潜伏期差异无统计学意义，表明无论是低频还是高频TMS均未对小鼠固有的运动能力产生明显影响。电刺激期中的错误次数表明，经低频（1 Hz）的bTMS和高频（5、10 Hz）的rTMS、bTMS后，小鼠短期被动逃避学习能力有所增加。被动逃避期中的逃避潜伏期和错误次数表明，经高频（5、10 Hz）TMS后，小鼠长期被动逃避学习能力有所增加。对比同一组别的电刺激期与被动逃避期数据，被动逃避期的错误次数低于电刺激期。已有研究表明，高频（20、25 Hz）rTMS可以提高老年小鼠在跳台实验被动逃避任务中的表现[19, 22]；与本研究结论一致。
海马体对记忆的形成和提取至关重要[23-24]，海马体内神经元对生理活动、疾病过程及神经毒性等的敏感性已被证实[25]。DG区是海马中学习记忆与空间编码的输入区，其功能之一是对传入信息进行预处理[26-27]。DG区颗粒细胞接受来自内嗅皮层的兴奋性神经元输入，并通过苔藓纤维将兴奋性输出发送到海马角3区；颗粒细胞还会参与记忆的维护，是海马实现记忆所必需的[24, 28]。细胞动作电位诱发频率通常表征细胞的兴奋性，频率越高表明细胞越易兴奋，对比行为学和细胞诱发动作电位频率可得，小鼠经不同频率TMS，其学习记忆能力与动作电位频率呈现同相变化趋势，猜测TMS是通过影响海马DG区颗粒神经元兴奋性来影响小鼠学习记忆能力。神经元兴奋性依赖于阈值电位[29]，动作电位特征分析表明，经过高频TMS后，阈值电位向静息电位方向靠近，表征了该神经元更易兴奋；阈值电位减后电位的减小表征了在超极化状态下，细胞更易恢复到可兴奋的状态；这二者变化表明，经高频TMS后给予相对低的电流刺激就可以诱发神经元的放电，表现为神经元兴奋性的提高。达峰时间的减少与上升支平均斜率的增加表征膜电位去极化过程的速率增加；下降支平均斜率的增加表征膜电位复极化速率的增加；这些变化与半波宽的减少呈现一致性；均表征了经高频TMS后细胞兴奋性的增加，与各组动作电位频率的增加呈现出高度的一致性。本研究结果显示，经高频（5、10 Hz）TMS后，小鼠海马DG区颗粒神经元兴奋性提高，此结果与已报道的研究结论一致[30-31]。
关于不同刺激模式之间的对比分析，本研究结果表明，在同一刺激频率下，众多结果分析中，只有阈值电位和动作电位下降支平均斜率在1 Hz时，不同刺激模式下的差异有统计学意义。双因素方差分析表明，除小鼠跳台实验适应潜伏期外，频率因素均表现为主效应有统计学意义；而除小鼠跳台电刺激期错误次数外，模式因素均未表现出主效应有统计学意义。同一频率下两种刺激模式结果无显著变化，其原因可能是各组的刺激脉冲数和刺激天数相同，因此导致bTMS和rTMS两种刺激对认知功能和神经元兴奋性的影响差异不具有统计学意义。在相同刺激频率和脉冲数下，bTMS组所需刺激时间更短，效率更高。
膜电位的变化与离子通道的开放密切相关，研究发现4周的10 Hz的rTMS可以改善小鼠的抑郁样行为，并在小鼠额叶区切片电生理中观测到TMS可使被抑制的大电导钙激活钾通道恢复活性[32]。电压门控钠离子通道参与大多数海马电兴奋性细胞动作电位的起始与传播，主要体现在动作电位的上升支。电压门控钾离子通道是神经元兴奋性的关键调节通道，主要体现在动作电位的下降支，同时也与静息膜电位的维持有关。电压门控钙离子通道同样也与动作电位的产生相关。有研究表明，连续14 d的TMS可以使小鼠海马角1区神经元动作电位的峰值和上升支最大斜率增加；同时观测到细胞电压门控钠、钙离子通道幅值的增加及钾离子通道幅值的降低[33]。有研究表明，20 Hz的rTMS即时作用可增加小鼠急性脑组织切片DG颗粒细胞动作电位的频率，影响电压门控钠、钾离子通道的变化；钠通道激活曲线向负电压方向移动，失活曲线向正电压方向移动，且恢复速度加快；钾通道激活曲线和失活曲线向负电压方向移动，且恢复速度变慢；提示激活钠通道、抑制钾通道可能是rTMS增强颗粒细胞兴奋性的机制之一[34]。由此推测，TMS对离子通道有重要的调节作用，故不同频率TMS对离子通道动力学的研究是下一步的重要工作；深入探究TMS对神经调控的生理机制仍是未来电磁神经调控研究的重点。
4 结论
本文研究表明，高频（5、10 Hz）rTMS与bTMS能提高小鼠记忆能力和神经元兴奋性，改变神经元电生理特征；通过调节海马DG区颗粒神经元兴奋性改变小鼠学习记忆行为，可能是TMS改善记忆功能的电生理机制之一。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：付蕊主要负责实验数据的采集和处理、论文撰写；朱海军主要负责实验指导以及数据分析指导；丁冲和徐桂芝主要负责论文审阅修订。
伦理声明：本研究通过了河北工业大学动物伦理委员会的审批（批文编号：HEBUTacuc2022028）。
0 引言
经颅磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）是Barker等[1]在1985年提出的作为间接、非侵入的神经调控技术，并于2008年经美国食品药品监督管理局批准，用于治疗重度抑郁症[2]。目前，TMS技术已在疾病诊断及治疗中展现出一定潜力。除抑郁症外，也尝试将TMS用于治疗焦虑症、阿尔茨海默病、帕金森病、血管性认知障碍、卒中后运动功能损伤等[3-6]。TMS可以诱导大脑活动变化，已成为研究人脑生理和行为关系的有力工具[7]。此外，TMS还可以与脑电图相结合，评估电磁感应对皮层振荡的影响[8]。
TMS的治疗效果取决于刺激的频率、脉冲数、强度、时长和潜在的大脑皮层活动状态[9-12]。其中，刺激频率被认为是决定刺激后效果的主要因素之一[13]。一般来说，较低频率（1 ≤ f < 5 Hz）的重复TMS（repetitive TMS，rTMS）会抑制皮层兴奋性；而较高频率（f ≥ 5 Hz，一般在5～25 Hz之间）的rTMS会增加皮质兴奋性[13-15]。即，低频rTMS抑制作用优于促进作用，而高频rTMS促进作用优于抑制作用[7]。但也有研究者在rTMS对皮质脊髓兴奋性影响的研究中发现，10 Hz组在该研究的全部疗程中均未发现明显变化[16]。θ短阵快速脉冲刺激（theta burst stimulation，TBS）与rTMS相较，能在较低的刺激强度和较短的刺激时间内产生强大而持久的效果[11, 17]。经典的TBS刺激模仿脑电发放的θ和γ节律，由γ频段3个50 Hz的高频短阵脉冲耦合5 Hz的θ频段节律组成，即3个50 Hz的高频短阵脉冲每200 ms发出一次[12, 14, 18]。短阵快速脉冲TMS（burst TMS，bTMS）是参考TBS模式后更改丛间频率而来，其中5 Hz的bTMS与标准TBS模式一致。目前，刺激频率与模式各异导致TMS改善认知功能的效果并不一致，且多从单一角度分析，很少有不同频率与模式的共同分析报道。基于此，本研究旨在研究不同频率与模式的TMS对小鼠学习记忆能力及海马齿状回（dentate gyrus，DG）颗粒神经元兴奋性的影响，以期从神经元兴奋性角度理解TMS改善认知功能的机制，为临床应用提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验设计
本研究对8周龄的昆明小鼠进行随机分组后，开展为期两周的刺激和伪刺激（sham）实验，采用新物体识别和跳台实验检测小鼠学习记忆能力，随后进行脑片膜片钳实验检测其神经元兴奋性，具体实验流程如图1所示。
图1
实验流程图
Figure1.
Experimental flowchart
1.2 实验动物和分组
本研究所有实验过程符合实验动物的使用准则，符合河北省动物实验开展要求，已通过河北工业大学动物伦理委员会的审批（批文编号：HEBUTacuc2022028）。实验所用动物购自华阜康生物科技有限公司；将8周龄昆明小鼠随机分成sham组和6种不同刺激方式的刺激组，共7组，每组6只。
（1）sham组：线圈垂直放置远离小鼠头部，小鼠只听到刺激声音，不接受TMS；
（2）1 Hz rTMS组：施加频率为1 Hz的rTMS，共60串脉冲，串持续时间为10 s，串间隔为10 s；
（3）5 Hz rTMS组：施加频率为5 Hz的rTMS，共20串脉冲，串持续时间为6 s，串间隔为10 s；
（4）10 Hz rTMS组：施加频率为10 Hz的rTMS，共20串脉冲，串持续时间为3 s，串间隔为10 s；
（5）1 Hz bTMS组：施加频率为1 Hz的bTMS，共20串脉冲，串持续时间为10 s，串间隔为10 s，串内脉冲均由3个50 Hz短阵快速脉冲组成；
（6）5 Hz bTMS组：施加频率为5 Hz的bTMS，共20串脉冲，串持续时间为2 s，串间隔为10 s，串内脉冲均由3个50 Hz短阵快速脉冲组成；
（7）10 Hz bTMS组：施加频率为10 Hz的bTMS，共20串脉冲，串持续时间为1 s，串间隔为10 s，串内脉冲均由3个50 Hz短阵快速脉冲组成。
1.3 经颅磁刺激
TMS设备采用重复脉冲磁刺激仪Rapid2（Magstim，英国），线圈采用标准八字形线圈D70 P/N9925-00（Magstim，英国），线圈输出的最大磁场强度为2.2 T。刺激组的刺激强度为15%线圈输出最大强度（约为0.3 T），每天进行600个脉冲刺激，连续进行14 d，刺激模式分别为rTMS和bTMS，频率分别为1、5、10 Hz。TMS方案如附图1所示。
1.4 新物体识别实验
新物体识别实验共分为四个阶段，分别是空箱适应期、物体熟悉期、测试Ⅰ期以及测试Ⅱ期；实验流程如附图2所示。在测试I期与测试II期录制视频用于分析，小鼠鼻尖触碰物体视为对物体的探索行为，分析小鼠在测试Ⅰ、Ⅱ期的认知指数来评估小鼠的空间学习记忆能力，认知指数由探索新物体时间除以探索新旧物体总时间计算所得。
图2
动作电位示意图
Figure2.
Schematic diagram of the action potential
1.5 跳台实验
跳台实验共分为四个阶段，分别是适应期、适应测试期、电刺激期以及被动逃避期；整个实验过程中，箱体内均有灯光光照；且在电刺激期以及被动逃避期，对跳台底部栅极施加幅值为28 V的电压；实验流程如附图3所示。适应测试期，小鼠首次跳下台子的时间记为适应潜伏期；电刺激期，从小鼠受到电击跳上台子开始计时，小鼠跳下跳台的次数记为错误次数；被动逃避期，小鼠首次跳下台子的时间记为逃避潜伏期，小鼠跳下的次数记为错误次数。
图3
新物体识别认知指数
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1.6 急性海马脑片制备
小鼠在麻醉状态下快速断头取脑，并将小鼠脑组织置于冰水混合且氧饱和的切片液中。使用振动切片机在大脑冠状平面上切取7～8片含有海马脑区的300 μm厚度的脑片。将脑片置于装有30 °C且氧饱和的人工脑脊液中，孵育1 h备用。溶液成分参考文献[19]所述，如附表1所示。
1.7 脑片膜片钳实验
采用全细胞记录模式，选取海马DG区颗粒细胞为目标细胞，目标细胞与充灌有电极内液的玻璃微电极形成高阻封接，细胞抽吸破膜后记录10 s内的电位值记为细胞的静息膜电位。选取静息膜电位在−70 mV左右的细胞，记录细胞在100、150、200 pA电流钳制下，500 ms内所诱发的动作电位个数，进行动作电位诱发频率分析。记录细胞在150 pA电流钳制下所诱发的单个动作电位，做动作电位动力学分析；动作电位特征包括阈值电位、阈值电位减后电位、达峰时间（指细胞从静息电位到达峰值电位的时间）、半波宽，以及上升支和下降支平均斜率，如图2所示。每只小鼠选取2个细胞信号，所有初始数据在多通道数据采集软件PatchMaster（HEKA，德国）上记录。电极内液成分参考文献[19]所述，如附表1所示。
1.8 数据统计分析
所有数据均以均值标准误的形式表示，刺激组与sham组对比采用单因素方差方法进行统计分析，不同模式刺激组之间采用双因素方差方法进行统计分析，检验标准为0.05，事后分析采用图基多重比较。
2 结果
2.1 新物体识别实验结果
如图3所示为新物体识别实验认知指数分析，刺激频率在测试Ⅰ期认知指数［rTMS：F（3，20） = 4.49，P =
2.2 跳台实验结果
如图4所示为跳台实验结果分析，各组小鼠的适应潜伏期差异无统计学意义，双因素方差分析中，刺激频率与刺激模式主效应没有统计学意义。在电刺激期错误次数分析中，刺激频率［rTMS：F（3，20） = 12.15，P < 0.01；bTMS：F（3，20） = 17.34，P < 0.01］主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及1、5、10 Hz的bTMS组，与sham组的错误次数差异有统计学意义；均少于sham组的错误次数［（7.3 ± 1.05）次］；双因素方差分析中，刺激频率［F（2，30） = 15.9，P < 0.01］和刺激模式［F（1，30） = 4.783，P =
图4
跳台实验结果分析
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2.3 电生理实验结果
2.3.1 不同电流钳制下动作电位频率分析
如图5所示为神经元动作电位频率分析，在100 pA［rTMS：F（3，44） = 61.03，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 60.13，P < 0.01］、150 pA［rTMS：F（3，44） = 43.6，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 49.03，P < 0.01］和200 pA［rTMS：F（3，44） = 29.26，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 37.49，P < 0.01］下刺激频率主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及5、10 Hz的bTMS组，与sham组的动作电位频率差异有统计学意义，均高于sham组动作电位频率［100 pA：（2.5 ± 0.78）Hz；150 pA：（9.5 ± 1.65）Hz；200 pA：（17.7 ± 1.44）Hz］。双因素方差分析中，刺激频率［100 pA：F（2，66） = 99.93，P < 0.01；150 pA：F（2，66） = 86.84，P < 0.01；200 pA：F（2，66） = 59.08，P < 0.01］主效应有统计学意义，刺激模式主效应没有统计学意义，二者不存在交互效应。
图5
动作电位频率分析
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2.3.2 动作电位动力学分析
如图6所示为神经元动作电位特征分析，刺激频率在动作电位的阈值电位［rTMS：F（3，44） = 64.3，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 56.9，P < 0.01］、阈值电位减后电位［rTMS：F（3，44） = 30.11，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 37.06，P < 0.01］、达峰时间［rTMS：F（3，44） = 73.44，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 33.63，P < 0.01］和半波宽［rTMS：F（3，44） = 25.96，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 19.3，P < 0.01］中主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及5、10 Hz的bTMS组，与sham组的差异有统计学意义，较sham组阈值电位［（−25.9 ± 1.22）mV］向静息电位方向移动；较sham组阈值电位减后电位［（17.7 ± 0.32）mV］减小，意味更加接近阈值电位，更利于产生动作电位；较sham组达峰时间［（5.4 ± 0.15） ms］缩短，较sham组半波宽［（2.1 ± 0.05）ms］减小。在双因素方差分析中，刺激频率在阈值电位［F（2，66） = 120.3，P < 0.01］、阈值电位减后电位［F（2，66） = 26.14，P < 0.01］、达峰时间［F（2，66） = 60.74，P < 0.01］和半波宽［F（2，66） = 56.8，P < 0.01］主效应有统计学意义，刺激模式主效应没有统计学意义。刺激频率与刺激模式仅在阈值电位中存在交互效应［F（2，66） = 5.663，P < 0.01］；事后分析表明，1 Hz的bTMS组阈值电位［（−32.6 ± 0.28）mV］较1 Hz的rTMS组阈值电位［（−29.3 ± 0.50）mV］向静息电位方向移动；其余指标中刺激频率与刺激模式不存在交互效应。
图6
动作电位特征分析
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如图7所示为神经元动作电位斜率分析，刺激频率在上升支平均斜率［rTMS：F（3，44） = 62.38，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 43.14，P < 0.01］与下降支平均斜率［rTMS：F（3，44） = 130，P < 0.01；bTMS：F（3，44） = 58.56，P < 0.01］中主效应有统计学意义，5、10 Hz的rTMS组以及1、5、10 Hz的bTMS组，与sham组的动作电位上升支平均斜率、下降支平均斜率差异有统计学意义，较sham组上升支平均斜率［（32.9 ± 0.60）mV/ms］与下降支平均斜率［（−23.6 ± 0.78）mV/ms］增加。双因素方差分析中，刺激频率在上升支平均斜率［F（2，66） = 67.3，P < 0.01］、下降支平均斜率［F（2，66） = 209.9，P < 0.01］中主效应有统计学意义，刺激模式主效应没有统计学意义，刺激频率与刺激模式在下降支平均斜率中存在交互效应［F（2，66） = 10.24，P < 0.01］。事后分析表明，1 Hz的bTMS组下降支平均斜率［（−26.8 ± 0.32）mV/ms］较1 Hz的rTMS组［（−24.6 ± 0.40）mV/ms］增加。
图7
动作电位斜率分析
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3 讨论
本文通过新物体识别及跳台实验，探究不同频率和模式的TMS对小鼠记忆功能的影响；并通过脑片膜片钳实验采集小鼠海马DG区颗粒神经元的动作电位，通过分析动作电位诱发频率、达峰时间、阈值电位、半波宽等相关特征探究TMS影响小鼠记忆功能的神经电生理机制。结果表明，高频（5、10 Hz）的rTMS与bTMS均可提高小鼠记忆能力和神经元兴奋性，提示高频TMS可通过提高海马DG区颗粒神经元兴奋性来提高小鼠记忆功能。
新物体识别和跳台实验是经典的啮齿类动物学习记忆认知功能实验。在新物体识别中进行了短期和长期的空间记忆相关任务，结果显示经高频（5、10 Hz）的TMS后小鼠空间记忆相关认知能力有所提升。对比同一组别的测试Ⅰ期与测试Ⅱ期的认知指数，测试Ⅰ期认知指数均略高于测试Ⅱ期。已有研究表明，高频TMS可以修复八齿鼠经睡眠剥夺后在新物体识别任务中认知功能的损伤[20-21]；20 Hz高频rTMS可以修复老年小鼠在老化过程中的认知损伤[19]；与本研究结论一致。
跳台实验结果表明，在未受电刺激训练的适应测试期中，各组小鼠适应潜伏期差异无统计学意义，表明无论是低频还是高频TMS均未对小鼠固有的运动能力产生明显影响。电刺激期中的错误次数表明，经低频（1 Hz）的bTMS和高频（5、10 Hz）的rTMS、bTMS后，小鼠短期被动逃避学习能力有所增加。被动逃避期中的逃避潜伏期和错误次数表明，经高频（5、10 Hz）TMS后，小鼠长期被动逃避学习能力有所增加。对比同一组别的电刺激期与被动逃避期数据，被动逃避期的错误次数低于电刺激期。已有研究表明，高频（20、25 Hz）rTMS可以提高老年小鼠在跳台实验被动逃避任务中的表现[19, 22]；与本研究结论一致。
海马体对记忆的形成和提取至关重要[23-24]，海马体内神经元对生理活动、疾病过程及神经毒性等的敏感性已被证实[25]。DG区是海马中学习记忆与空间编码的输入区，其功能之一是对传入信息进行预处理[26-27]。DG区颗粒细胞接受来自内嗅皮层的兴奋性神经元输入，并通过苔藓纤维将兴奋性输出发送到海马角3区；颗粒细胞还会参与记忆的维护，是海马实现记忆所必需的[24, 28]。细胞动作电位诱发频率通常表征细胞的兴奋性，频率越高表明细胞越易兴奋，对比行为学和细胞诱发动作电位频率可得，小鼠经不同频率TMS，其学习记忆能力与动作电位频率呈现同相变化趋势，猜测TMS是通过影响海马DG区颗粒神经元兴奋性来影响小鼠学习记忆能力。神经元兴奋性依赖于阈值电位[29]，动作电位特征分析表明，经过高频TMS后，阈值电位向静息电位方向靠近，表征了该神经元更易兴奋；阈值电位减后电位的减小表征了在超极化状态下，细胞更易恢复到可兴奋的状态；这二者变化表明，经高频TMS后给予相对低的电流刺激就可以诱发神经元的放电，表现为神经元兴奋性的提高。达峰时间的减少与上升支平均斜率的增加表征膜电位去极化过程的速率增加；下降支平均斜率的增加表征膜电位复极化速率的增加；这些变化与半波宽的减少呈现一致性；均表征了经高频TMS后细胞兴奋性的增加，与各组动作电位频率的增加呈现出高度的一致性。本研究结果显示，经高频（5、10 Hz）TMS后，小鼠海马DG区颗粒神经元兴奋性提高，此结果与已报道的研究结论一致[30-31]。
关于不同刺激模式之间的对比分析，本研究结果表明，在同一刺激频率下，众多结果分析中，只有阈值电位和动作电位下降支平均斜率在1 Hz时，不同刺激模式下的差异有统计学意义。双因素方差分析表明，除小鼠跳台实验适应潜伏期外，频率因素均表现为主效应有统计学意义；而除小鼠跳台电刺激期错误次数外，模式因素均未表现出主效应有统计学意义。同一频率下两种刺激模式结果无显著变化，其原因可能是各组的刺激脉冲数和刺激天数相同，因此导致bTMS和rTMS两种刺激对认知功能和神经元兴奋性的影响差异不具有统计学意义。在相同刺激频率和脉冲数下，bTMS组所需刺激时间更短，效率更高。
膜电位的变化与离子通道的开放密切相关，研究发现4周的10 Hz的rTMS可以改善小鼠的抑郁样行为，并在小鼠额叶区切片电生理中观测到TMS可使被抑制的大电导钙激活钾通道恢复活性[32]。电压门控钠离子通道参与大多数海马电兴奋性细胞动作电位的起始与传播，主要体现在动作电位的上升支。电压门控钾离子通道是神经元兴奋性的关键调节通道，主要体现在动作电位的下降支，同时也与静息膜电位的维持有关。电压门控钙离子通道同样也与动作电位的产生相关。有研究表明，连续14 d的TMS可以使小鼠海马角1区神经元动作电位的峰值和上升支最大斜率增加；同时观测到细胞电压门控钠、钙离子通道幅值的增加及钾离子通道幅值的降低[33]。有研究表明，20 Hz的rTMS即时作用可增加小鼠急性脑组织切片DG颗粒细胞动作电位的频率，影响电压门控钠、钾离子通道的变化；钠通道激活曲线向负电压方向移动，失活曲线向正电压方向移动，且恢复速度加快；钾通道激活曲线和失活曲线向负电压方向移动，且恢复速度变慢；提示激活钠通道、抑制钾通道可能是rTMS增强颗粒细胞兴奋性的机制之一[34]。由此推测，TMS对离子通道有重要的调节作用，故不同频率TMS对离子通道动力学的研究是下一步的重要工作；深入探究TMS对神经调控的生理机制仍是未来电磁神经调控研究的重点。
4 结论
本文研究表明，高频（5、10 Hz）rTMS与bTMS能提高小鼠记忆能力和神经元兴奋性，改变神经元电生理特征；通过调节海马DG区颗粒神经元兴奋性改变小鼠学习记忆行为，可能是TMS改善记忆功能的电生理机制之一。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：付蕊主要负责实验数据的采集和处理、论文撰写；朱海军主要负责实验指导以及数据分析指导；丁冲和徐桂芝主要负责论文审阅修订。
伦理声明：本研究通过了河北工业大学动物伦理委员会的审批（批文编号：HEBUTacuc2022028）。
