磷酸钙骨水泥(CPC)因具有良好的生物活性和生物相容性, 目前已成功应用于临床。磷酸钙骨水泥从制备到应用避免了高温烧结的过程, 是各类药物和高分子材料的优良载体。本文综述了近年来微球以及各类载药微球与磷酸钙骨水泥相结合的应用, 主要从药物缓释、快速降解、形成多孔支架以及改善力学性能这几个方面论述了微球在磷酸钙骨水泥临床应用中的作用。本文通过分析总结微球改善磷酸钙骨水泥性能的原理及方法, 为今后进一步改进、制备符合临床使用要求的理想型磷酸钙骨水泥奠定了理论基础。
引用本文： 林孙忠, 屈树新, 薛继鑫, 林婵娟, 徐小普, 翁杰. 微球在磷酸钙骨水泥中的应用. 生物医学工程学杂志, 2016, 33(4): 806-811. doi: 10.7507/1001-5515.20160130 复制
引言
磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是1986年由Brown和Chow研制的人工骨替代材料，1991年获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批准开始应用于临床[1-2]。CPC包括磷酸钙粉末(固相)和固化液(液相)两个部分，将两者混合均匀后能在室温自固化，制备过程避免了高温烧结工艺，适合作为药物和各类高分子的载体材料。但是CPC降解缓慢，且不具备促进新骨组织生成的孔隙结构，引导骨组织生长的能力有限。目前，改善这一性能的方式主要有两种：①是载入各类促进骨组织生长的药物，②是制备多孔CPC[2-4]。
药物微囊化技术已相对成熟，通过改变微球的粒径、高分子的分子量以及高分子上合成接枝等手段可以调控载药微球的药物释放速度、降解速度和靶向作用等[2, 5-7]。因此针对CPC的结构缺陷，众多研究者在CPC中载入高分子微球，尝试从微球降解、药物缓释调控等方面来改善CPC的骨修复性能[8-13]。Simon等[8]首次制备了载聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(dl-lactic-co-glycolic acid), PLGA]微球的CPC，在骨修复前期，PLGA微球可以提供强度支持；随着PLGA降解，载微球CPC可为新骨组织的长入提供较大的孔隙，最终被新生骨组织取代。进一步研究表明，载微球的CPC具有良好的生物相容性，可吸收，能成孔，可塑形，是理想的骨修复材料[10-13]。本文主要从药物缓释、形成多孔支架以及改善力学性能等几个方面论述了载微球CPC在临床骨缺损修复中的作用。
1 微球在CPC药物释放体系中的应用
CPC载药体系的制备大致包括两部分：首先，将药物与CPC粉末或固化液通过物理混合的方式使药物分散均匀；其次，再将固相和液相混合均匀即可制备得到载药CPC。研究表明，CPC存在大量微小孔隙，可为药物释放提供通道，药物通过溶解扩散迅速释放，所以CPC载药体系的药物释放基本集中在前两周[14-15]。然而，临床许多骨缺损伴随着骨科疾病，如慢性骨髓炎、骨肿瘤等都需要长期的药物治疗，单纯的CPC载药体系已不能够满足临床治疗过程中对于药物长期供给的需求[15]。许多研究者将药物通过聚乳酸(polylactic acid, PLA)、PLGA、明胶、壳聚糖等各类高分子微球包裹之后，再通过物理混合的方式将载药微球载入到CPC之中制备了载微球CPC药物缓释体系，微球被骨水泥紧密包裹，药物释放则受到微球和CPC的双重阻碍，成功地延长了药物释放时间[2, 10-13]。
Zhong等[11]在CPC中载入载鲑降钙素的PLGA微球，体外药物释放时间超过35 d。Loca等[12]将载万古霉素的PLA微球载入CPC中，药物突释明显减少，并且药物释放延长至43 d时，释放量才为30.4%±1.3%。因此，载微球CPC能够有效地延缓药物释放，满足临床对于药物长期供给的需求，是理想的药物缓释体系。另有研究表明，通过液相直接将骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)载入CPC中，或者先将生长因子通过物理吸附结合到PLGA微球表面，再载入到CPC中，以这两种方式都可得到长达28 d的药物释放曲线，而且非常相似，但是先将BMP-2吸附在PLGA微球表面的情况下，前期的药物突释明显减少[16]。这一研究表明，在载微球CPC这一药物缓释体系中，微球不仅可以通过包裹药物达到缓释的效果，还可以通过微球对药物的物理吸附进一步延缓药物的释放、减少药物释放前期的快速突释。
Habraken等[17]以牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)为药物模型，研究了药物在载微球CPC中的释放机理。不同于载药微球或载药CPC，BSA/PLGA/CPC载药体系将药物先行包裹于PLGA微球中形成载药微球，再将载药微球载入CPC之中，药物受到多重包裹，从微球中释放出来的药物将受到微球和CPC基体的重新吸附，从而显著性地延缓药物的释放。因此，载微球CPC药物缓释体系的药物释放前期，只有少量的初始释放，且后期的药物缓释时间也明显延长。同时，PLA、PLGA等微球降解时将产生酸性单体，导致pH下降、CPC降解加速、进一步使得整体孔隙率增加，而这一系列变化将逐步加速载微球CPC后期的药物缓释，使药物释放更加彻底、药物释放效率更高。Habraken等[18]进一步对比研究了转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及BMP-2在载微球CPC药物释放体系中的药物释放，均包括前期突释和其后较长一段时间的缓慢释放。而在各种不同的载药量下，bFGF的药物突释量均高于TGF-β1和BMP-2的药物突释量，六周后缓慢释放的药物量和药物释放效率(释放的药物占载入总量的百分比)的排序始终为bFGF> BMP-2≥TGF-β1。由此可见，药物释放模式及其效率基本取决于生长因子的类型，而与载入量无关，造成这一现象的原因主要有以下两方面：一是由于各种药物的分子结构和亲疏水性各不相同，导致微球对药物的包裹效率和吸附性能也存在较大差异；另一方面，CPC对蛋白质具有较强的吸附能力，CPC水化后基本转化为羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)，六面晶系的HA晶体具有暴露的钙离子点，容易与羧基等带负离子的基团结合、吸附，从而延缓药物释放，改变药物的释放效率。因此，当载微球CPC固定不变时，是分子结构类型最终决定了药物在该缓释体系中释放模式及释放效率等方面的不同。
研究表明，载微球CPC体系释放的药物，依旧可以保持原有的药物活性[10-13, 19]。而且，相对于直接载入重组人骨形成蛋白-2(recombinanthuman BMP-2, rhBMP-2)的对照组，载微球CPC缓释体系可以释放更多保持原有药物活性的rhBMP-2[19]。另有研究表明，药物活性的保持与药物的载入方式有关，只有将核因子κ B受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)吸附到PLGA微球上，再载入CPC中，才能获得具有活性的RANKL的缓慢释放。先将RANKL载入到微球内或直接加入到CPC液相中，释放出来的RANKL将失去活性[20]。总体而言，载微球CPC是优良的药物缓释体系，在各类药物的释放机理、药物活性保持以及CPC的多重载药等方面需要进一步深入研究。
2 载入微球调节CPC降解并形成多孔结构的研究
CPC植入骨缺损部位后，降解缓慢，无法及时为新生骨组织提供所需的生长空间，为解决这一问题，研究者通过O2或CO2汽泡、CaSO4·2H2O、NaHCO3等造孔剂制备了CPC多孔支架，但是该支架力学强度太低[21-28]。另有研究表明，多孔CPC支架中的孔隙(尤其是大于100 μm的贯通孔隙结构)可以显著地促进新骨组织生成[2, 10, 13, 21]。
为了提高降解速度，同时引入较大的贯通孔隙结构，许多研究者在CPC中载入可降解高分子微球[8-10, 22-23]。Simon等[8]首次制备了载PLGA微球的CPC，微球可以改善CPC的降解性能，并在保证植入初期具有一定的力学性能的同时，随着PLGA的降解可为新骨组织的长入提供较大的孔隙。进一步研究表明，从第六周开始，PLGA降解导致样品质量和浸泡液的pH明显下降[17, 23]。载入PLGA微球质量百分比达20%时，载微球CPC的降解显著加快，CPC基体也出现了降解。降解12周后，形成了高孔隙率的支架。成骨细胞可以在样品上大量黏附、增殖，表明载PLGA微球的CPC具有良好的生物相容性、可吸收、能成孔，是理想的骨修复材料[8, 17, 23]。
PLGA等微球降解会产生乙醇酸等酸性单体，将导致环境中pH下降，促进CPC进一步降解[24-27, 29]。并且最新研究表明在浸泡液不灌注、不搅拌的情况下，液体酸化和降解速度都明显加快[29]。同时，PLGA的分子量和末端基团是否封闭等对PLGA和CPC的降解都有影响，但是影响主要取决于末端基团的性质，末端基团以酸终止的PLGA微球降解更快、产生的酸性分解物更多、孔隙率更高[25-26]。Lanao等[25-26]进一步从形态特征方面研究了微球载入对CPC体外降解的影响。相比于空心PLGA微球，实心PLGA微球的载入可以显著提高降解速度，是更加有效的成孔剂。造成这一现象的原因之一可能是实心微球中PLGA的含量更高，分解产生的乙醇酸更多，导致CPC基体降解更快，产生的孔隙率更高。而CPC中载入中空或实心PLGA微球，对于新骨组织的长入并没有产生明显的区别[27]。
除了PLGA微球之外，壳聚糖、葡萄糖酸内酯(Glucono-δ-lactone, GDL)和明胶等高分子微球也被广泛采用[24, 30]。Lanao等[31]通过载入GDL微球来加速CPC的降解，体外浸泡降解1 d即可形成大量孔隙，植入动物体内2周后，相比于载入PLGA微球或明胶微球的对照组，降解速度更快，并可加速新生骨组织的长入，但是不适合作为长期药物缓释的载体。综上所述，可以根据临床需求载入不同的高分子微球或者按一定比例载入不同类型的高分子微球，调节CPC的降解速度和孔隙的生成速度，也可以根据需要将CPC植入初期所需的抗感染药物和促进骨修复等功能的长期需求药物载入到不同类别高分子微球，再同时载入CPC中，达到阶段性药物释放的效果。目前对载多种微球CPC和载多种药物CPC的研究尚少，需要进一步深入研究。
3 载入微球改善多孔CPC支架的力学性能的研究
CPC是脆性材料，抗压强度较低(10~100 MPa)，只适用于非承重骨组织且降解过于缓慢，无法为新骨组织提供所需的生长空间[2, 28, 32]。另外，通过各类造孔剂制备的CPC多孔支架力学强度更低[27, 28]。而研究表明，载微球CPC既能改善CPC的力学强度又能加速降解形成多孔孔隙结构[26-27, 33]。例如，在CPC中载入聚三亚甲基碳酸酯[poly (trimethylene carbonate), PTMC]微球、PLGA微球以及水凝胶微球等均可以明显改善CPC的脆性，材料的弹性、粘度和屈服强度等随着载入微球量的增加而增强[28, 32]。Theinhan等[32]通过载入水凝胶微球和壳聚糖纤维制备了非刚性的CPC，其力学强度达到了松质骨的强度，拉伸破坏时的轴向应变从普通CPC的0.05%提高到了10.7%，抗弯强度是刚性CPC的4倍，断裂功增强了20倍。因此，载入高分子微球可增强CPC整体的韧性，并使CPC在骨修复初期维持应有的力学强度，植入骨缺损部位后，再随着微球缓慢降解为新生骨组织的长入提供所需的孔隙结构[26-27, 33]。
但是，载入微球对力学强度的影响和变化机理等有待进一步研究，其中影响因素包括：微球的大小、形态、类型、载入量以及CPC的固液比等。Habraken等[23]分别研究了载PLGA微球和PTMC微球的CPC，CPC的抗压强度均随微球的载入而减小。载入质量百分比为20%的PLGA微球后，CPC的抗压强度降至4.3 MPa，体外降解12周后形成了高孔隙率、高强度的支架，其它研究者也得到了类似的结果[23, 28, 34]。Wu等[34]在CPC中载入微球后，其抗压强度也有一定程度的降低；随后载入β-磷酸三钙(Beta tricalcium phosphate，β-TCP)颗粒，可以在提高力学强度的同时缩短凝固时间，消除微球载入带来的影响。因此我们建议，微球载入对CPC力学强度变化的研究难度较大，除了优化各类变量之外，可以尝试配合软件模拟分析等方法多角度探究力学强度的变化机理。
4 微球载入对CPC临床使用可操作性、骨修复性能的影响
CPC的凝固时间决定了手术的可操作性，时间过短或过长都不利于手术的进行，一般凝固时间要在4~15 min [2, 10]。研究表明，载入各类高分子微球，CPC的凝固时间均有不同程度的延长[23, 28, 31-34]。而载入多糖类的果胶微球或者硫酸钙二水合物(Calcium sulfate dihydrate，CSD)等可以缩短CPC的凝固时间[20, 28, 34]。因此，需要通过限制微球载入量以及微球载入种类等方式来减弱微球对凝固时间的影响。Cai等[35]在载高分子微球CPC中同时载入质量百分比低于5%的CSD，CSD既可以缩短载微球CPC的凝固时间，同时提高了CPC的抗压强度。另外，微球载入使CPC的可注射性逐渐变差，但是在微球载入质量百分比不高于20%时，CPC的可注射性不会发生显著性变化[23, 28]。Qi等[28]研究发现载入质量百分比为20%的PLGA微球时，CPC的可注射性能系数[如式(1)所示]仍高于95%，具有可观的应用前景。综上所述，微球载入对CPC的临床使用并未造成明显的影响，载微球CPC具有优良的临床使用可操作性。
CPC的可注射性系数的定义如下[28]：
| $可注射性系数\% = 从注射器中排出的量/注射之前的总重量$ |
各类细胞实验和动物实验表明，载微球CPC的骨修复性能更优异，是更加优良的骨修复材料[21, 33-34, 36-37]。Habraken等[13]在兔子脊柱的两侧植入载微球CPC，4周后，骨组织紧密结合处发现有新生骨组织生成；植入12周后，新生骨组织在微球降解产生的孔隙结构中明显长入。同时，研究表明增加微球的载入量或者载入降解速度更快的微球可以加速CPC复合材料的降解，并进一步提高新生骨组织的长入量[22, 31]。除了载入量之外，Lanao等[38]从微球形态学方面对比研究了载中空PLGA微球、实心PLGA微球的CPC。不论有无载入药物，载实心微球CPC植入后生成的新生骨组织的量都显著提高，在载入中空微球的情况下，同时载入血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor, PDGF)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)，两种药物联合使用才可以促进骨组织的生长。由此可见，相比于空白CPC，载微球CPC在促进骨缺损修复方面具有明显的优势，是更加优良的骨修复材料；另外，可以通过控制微球载入量、载入药物以及控制微球形态等方式来调节载微球CPC的骨修复性能。
5 展望
载微球CPC是理想的骨修复材料，具有生物相容性良好、可吸收、能成孔、可塑形、可载药并可实现长期缓释，同时在植入前期具有较高的力学强度等优点，必将成为一个新的发展方向。但是，微球载入后CPC力学强度变化的机理、CPC和各类微球同时作为药物载体载入多组份药物以及如何高效地保持载入生长因子的活性等大量涉及多重变量的课题尚需要进一步深入研究。
引言
磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)是1986年由Brown和Chow研制的人工骨替代材料，1991年获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批准开始应用于临床[1-2]。CPC包括磷酸钙粉末(固相)和固化液(液相)两个部分，将两者混合均匀后能在室温自固化，制备过程避免了高温烧结工艺，适合作为药物和各类高分子的载体材料。但是CPC降解缓慢，且不具备促进新骨组织生成的孔隙结构，引导骨组织生长的能力有限。目前，改善这一性能的方式主要有两种：①是载入各类促进骨组织生长的药物，②是制备多孔CPC[2-4]。
药物微囊化技术已相对成熟，通过改变微球的粒径、高分子的分子量以及高分子上合成接枝等手段可以调控载药微球的药物释放速度、降解速度和靶向作用等[2, 5-7]。因此针对CPC的结构缺陷，众多研究者在CPC中载入高分子微球，尝试从微球降解、药物缓释调控等方面来改善CPC的骨修复性能[8-13]。Simon等[8]首次制备了载聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(dl-lactic-co-glycolic acid), PLGA]微球的CPC，在骨修复前期，PLGA微球可以提供强度支持；随着PLGA降解，载微球CPC可为新骨组织的长入提供较大的孔隙，最终被新生骨组织取代。进一步研究表明，载微球的CPC具有良好的生物相容性，可吸收，能成孔，可塑形，是理想的骨修复材料[10-13]。本文主要从药物缓释、形成多孔支架以及改善力学性能等几个方面论述了载微球CPC在临床骨缺损修复中的作用。
1 微球在CPC药物释放体系中的应用
CPC载药体系的制备大致包括两部分：首先，将药物与CPC粉末或固化液通过物理混合的方式使药物分散均匀；其次，再将固相和液相混合均匀即可制备得到载药CPC。研究表明，CPC存在大量微小孔隙，可为药物释放提供通道，药物通过溶解扩散迅速释放，所以CPC载药体系的药物释放基本集中在前两周[14-15]。然而，临床许多骨缺损伴随着骨科疾病，如慢性骨髓炎、骨肿瘤等都需要长期的药物治疗，单纯的CPC载药体系已不能够满足临床治疗过程中对于药物长期供给的需求[15]。许多研究者将药物通过聚乳酸(polylactic acid, PLA)、PLGA、明胶、壳聚糖等各类高分子微球包裹之后，再通过物理混合的方式将载药微球载入到CPC之中制备了载微球CPC药物缓释体系，微球被骨水泥紧密包裹，药物释放则受到微球和CPC的双重阻碍，成功地延长了药物释放时间[2, 10-13]。
Zhong等[11]在CPC中载入载鲑降钙素的PLGA微球，体外药物释放时间超过35 d。Loca等[12]将载万古霉素的PLA微球载入CPC中，药物突释明显减少，并且药物释放延长至43 d时，释放量才为30.4%±1.3%。因此，载微球CPC能够有效地延缓药物释放，满足临床对于药物长期供给的需求，是理想的药物缓释体系。另有研究表明，通过液相直接将骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)载入CPC中，或者先将生长因子通过物理吸附结合到PLGA微球表面，再载入到CPC中，以这两种方式都可得到长达28 d的药物释放曲线，而且非常相似，但是先将BMP-2吸附在PLGA微球表面的情况下，前期的药物突释明显减少[16]。这一研究表明，在载微球CPC这一药物缓释体系中，微球不仅可以通过包裹药物达到缓释的效果，还可以通过微球对药物的物理吸附进一步延缓药物的释放、减少药物释放前期的快速突释。
Habraken等[17]以牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)为药物模型，研究了药物在载微球CPC中的释放机理。不同于载药微球或载药CPC，BSA/PLGA/CPC载药体系将药物先行包裹于PLGA微球中形成载药微球，再将载药微球载入CPC之中，药物受到多重包裹，从微球中释放出来的药物将受到微球和CPC基体的重新吸附，从而显著性地延缓药物的释放。因此，载微球CPC药物缓释体系的药物释放前期，只有少量的初始释放，且后期的药物缓释时间也明显延长。同时，PLA、PLGA等微球降解时将产生酸性单体，导致pH下降、CPC降解加速、进一步使得整体孔隙率增加，而这一系列变化将逐步加速载微球CPC后期的药物缓释，使药物释放更加彻底、药物释放效率更高。Habraken等[18]进一步对比研究了转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、碱性纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及BMP-2在载微球CPC药物释放体系中的药物释放，均包括前期突释和其后较长一段时间的缓慢释放。而在各种不同的载药量下，bFGF的药物突释量均高于TGF-β1和BMP-2的药物突释量，六周后缓慢释放的药物量和药物释放效率(释放的药物占载入总量的百分比)的排序始终为bFGF> BMP-2≥TGF-β1。由此可见，药物释放模式及其效率基本取决于生长因子的类型，而与载入量无关，造成这一现象的原因主要有以下两方面：一是由于各种药物的分子结构和亲疏水性各不相同，导致微球对药物的包裹效率和吸附性能也存在较大差异；另一方面，CPC对蛋白质具有较强的吸附能力，CPC水化后基本转化为羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)，六面晶系的HA晶体具有暴露的钙离子点，容易与羧基等带负离子的基团结合、吸附，从而延缓药物释放，改变药物的释放效率。因此，当载微球CPC固定不变时，是分子结构类型最终决定了药物在该缓释体系中释放模式及释放效率等方面的不同。
研究表明，载微球CPC体系释放的药物，依旧可以保持原有的药物活性[10-13, 19]。而且，相对于直接载入重组人骨形成蛋白-2(recombinanthuman BMP-2, rhBMP-2)的对照组，载微球CPC缓释体系可以释放更多保持原有药物活性的rhBMP-2[19]。另有研究表明，药物活性的保持与药物的载入方式有关，只有将核因子κ B受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL)吸附到PLGA微球上，再载入CPC中，才能获得具有活性的RANKL的缓慢释放。先将RANKL载入到微球内或直接加入到CPC液相中，释放出来的RANKL将失去活性[20]。总体而言，载微球CPC是优良的药物缓释体系，在各类药物的释放机理、药物活性保持以及CPC的多重载药等方面需要进一步深入研究。
2 载入微球调节CPC降解并形成多孔结构的研究
CPC植入骨缺损部位后，降解缓慢，无法及时为新生骨组织提供所需的生长空间，为解决这一问题，研究者通过O2或CO2汽泡、CaSO4·2H2O、NaHCO3等造孔剂制备了CPC多孔支架，但是该支架力学强度太低[21-28]。另有研究表明，多孔CPC支架中的孔隙(尤其是大于100 μm的贯通孔隙结构)可以显著地促进新骨组织生成[2, 10, 13, 21]。
为了提高降解速度，同时引入较大的贯通孔隙结构，许多研究者在CPC中载入可降解高分子微球[8-10, 22-23]。Simon等[8]首次制备了载PLGA微球的CPC，微球可以改善CPC的降解性能，并在保证植入初期具有一定的力学性能的同时，随着PLGA的降解可为新骨组织的长入提供较大的孔隙。进一步研究表明，从第六周开始，PLGA降解导致样品质量和浸泡液的pH明显下降[17, 23]。载入PLGA微球质量百分比达20%时，载微球CPC的降解显著加快，CPC基体也出现了降解。降解12周后，形成了高孔隙率的支架。成骨细胞可以在样品上大量黏附、增殖，表明载PLGA微球的CPC具有良好的生物相容性、可吸收、能成孔，是理想的骨修复材料[8, 17, 23]。
PLGA等微球降解会产生乙醇酸等酸性单体，将导致环境中pH下降，促进CPC进一步降解[24-27, 29]。并且最新研究表明在浸泡液不灌注、不搅拌的情况下，液体酸化和降解速度都明显加快[29]。同时，PLGA的分子量和末端基团是否封闭等对PLGA和CPC的降解都有影响，但是影响主要取决于末端基团的性质，末端基团以酸终止的PLGA微球降解更快、产生的酸性分解物更多、孔隙率更高[25-26]。Lanao等[25-26]进一步从形态特征方面研究了微球载入对CPC体外降解的影响。相比于空心PLGA微球，实心PLGA微球的载入可以显著提高降解速度，是更加有效的成孔剂。造成这一现象的原因之一可能是实心微球中PLGA的含量更高，分解产生的乙醇酸更多，导致CPC基体降解更快，产生的孔隙率更高。而CPC中载入中空或实心PLGA微球，对于新骨组织的长入并没有产生明显的区别[27]。
除了PLGA微球之外，壳聚糖、葡萄糖酸内酯(Glucono-δ-lactone, GDL)和明胶等高分子微球也被广泛采用[24, 30]。Lanao等[31]通过载入GDL微球来加速CPC的降解，体外浸泡降解1 d即可形成大量孔隙，植入动物体内2周后，相比于载入PLGA微球或明胶微球的对照组，降解速度更快，并可加速新生骨组织的长入，但是不适合作为长期药物缓释的载体。综上所述，可以根据临床需求载入不同的高分子微球或者按一定比例载入不同类型的高分子微球，调节CPC的降解速度和孔隙的生成速度，也可以根据需要将CPC植入初期所需的抗感染药物和促进骨修复等功能的长期需求药物载入到不同类别高分子微球，再同时载入CPC中，达到阶段性药物释放的效果。目前对载多种微球CPC和载多种药物CPC的研究尚少，需要进一步深入研究。
3 载入微球改善多孔CPC支架的力学性能的研究
CPC是脆性材料，抗压强度较低(10~100 MPa)，只适用于非承重骨组织且降解过于缓慢，无法为新骨组织提供所需的生长空间[2, 28, 32]。另外，通过各类造孔剂制备的CPC多孔支架力学强度更低[27, 28]。而研究表明，载微球CPC既能改善CPC的力学强度又能加速降解形成多孔孔隙结构[26-27, 33]。例如，在CPC中载入聚三亚甲基碳酸酯[poly (trimethylene carbonate), PTMC]微球、PLGA微球以及水凝胶微球等均可以明显改善CPC的脆性，材料的弹性、粘度和屈服强度等随着载入微球量的增加而增强[28, 32]。Theinhan等[32]通过载入水凝胶微球和壳聚糖纤维制备了非刚性的CPC，其力学强度达到了松质骨的强度，拉伸破坏时的轴向应变从普通CPC的0.05%提高到了10.7%，抗弯强度是刚性CPC的4倍，断裂功增强了20倍。因此，载入高分子微球可增强CPC整体的韧性，并使CPC在骨修复初期维持应有的力学强度，植入骨缺损部位后，再随着微球缓慢降解为新生骨组织的长入提供所需的孔隙结构[26-27, 33]。
但是，载入微球对力学强度的影响和变化机理等有待进一步研究，其中影响因素包括：微球的大小、形态、类型、载入量以及CPC的固液比等。Habraken等[23]分别研究了载PLGA微球和PTMC微球的CPC，CPC的抗压强度均随微球的载入而减小。载入质量百分比为20%的PLGA微球后，CPC的抗压强度降至4.3 MPa，体外降解12周后形成了高孔隙率、高强度的支架，其它研究者也得到了类似的结果[23, 28, 34]。Wu等[34]在CPC中载入微球后，其抗压强度也有一定程度的降低；随后载入β-磷酸三钙(Beta tricalcium phosphate，β-TCP)颗粒，可以在提高力学强度的同时缩短凝固时间，消除微球载入带来的影响。因此我们建议，微球载入对CPC力学强度变化的研究难度较大，除了优化各类变量之外，可以尝试配合软件模拟分析等方法多角度探究力学强度的变化机理。
4 微球载入对CPC临床使用可操作性、骨修复性能的影响
CPC的凝固时间决定了手术的可操作性，时间过短或过长都不利于手术的进行，一般凝固时间要在4~15 min [2, 10]。研究表明，载入各类高分子微球，CPC的凝固时间均有不同程度的延长[23, 28, 31-34]。而载入多糖类的果胶微球或者硫酸钙二水合物(Calcium sulfate dihydrate，CSD)等可以缩短CPC的凝固时间[20, 28, 34]。因此，需要通过限制微球载入量以及微球载入种类等方式来减弱微球对凝固时间的影响。Cai等[35]在载高分子微球CPC中同时载入质量百分比低于5%的CSD，CSD既可以缩短载微球CPC的凝固时间，同时提高了CPC的抗压强度。另外，微球载入使CPC的可注射性逐渐变差，但是在微球载入质量百分比不高于20%时，CPC的可注射性不会发生显著性变化[23, 28]。Qi等[28]研究发现载入质量百分比为20%的PLGA微球时，CPC的可注射性能系数[如式(1)所示]仍高于95%，具有可观的应用前景。综上所述，微球载入对CPC的临床使用并未造成明显的影响，载微球CPC具有优良的临床使用可操作性。
CPC的可注射性系数的定义如下[28]：
| $可注射性系数\% = 从注射器中排出的量/注射之前的总重量$ |
各类细胞实验和动物实验表明，载微球CPC的骨修复性能更优异，是更加优良的骨修复材料[21, 33-34, 36-37]。Habraken等[13]在兔子脊柱的两侧植入载微球CPC，4周后，骨组织紧密结合处发现有新生骨组织生成；植入12周后，新生骨组织在微球降解产生的孔隙结构中明显长入。同时，研究表明增加微球的载入量或者载入降解速度更快的微球可以加速CPC复合材料的降解，并进一步提高新生骨组织的长入量[22, 31]。除了载入量之外，Lanao等[38]从微球形态学方面对比研究了载中空PLGA微球、实心PLGA微球的CPC。不论有无载入药物，载实心微球CPC植入后生成的新生骨组织的量都显著提高，在载入中空微球的情况下，同时载入血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor, PDGF)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)，两种药物联合使用才可以促进骨组织的生长。由此可见，相比于空白CPC，载微球CPC在促进骨缺损修复方面具有明显的优势，是更加优良的骨修复材料；另外，可以通过控制微球载入量、载入药物以及控制微球形态等方式来调节载微球CPC的骨修复性能。
5 展望
载微球CPC是理想的骨修复材料，具有生物相容性良好、可吸收、能成孔、可塑形、可载药并可实现长期缓释，同时在植入前期具有较高的力学强度等优点，必将成为一个新的发展方向。但是，微球载入后CPC力学强度变化的机理、CPC和各类微球同时作为药物载体载入多组份药物以及如何高效地保持载入生长因子的活性等大量涉及多重变量的课题尚需要进一步深入研究。