根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染293Cre4细胞,与辅助病毒H14连续共感染,获得HDAd/HA载体,并大量制备和纯化,进行形态观察和体外感染的初步鉴定。透射电镜下观察HDAd/HA载体具有典型腺病毒形态;与辅助病毒H14共感染293细胞,RT-PCR检测HA基因有转录,显示成功构建HDAd/HA重组腺病毒载体,为甲型流感病毒体内免疫效果和免疫保护作用的研究奠定实验基础。
引用本文： 张梅, 江彦泽, 陈念华, 付远辉, 乔伟, 王荷, 何金生. 可表达新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(1): 157-160. doi: 10.7507/1001-5515.20140031 复制
引言
甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，可使病毒获得感染性，并能刺激机体产生特异性中和抗体，在抗病毒感染中发挥重要作用。HA是流感病毒基因组第四节段的产物，很容易变异。2009年在墨西哥首先出现的甲型H1Nl流感，很快出现世界范围内的人与人之间的广泛传播。进化分析显示此次病原体为发生基因重排的，同时含禽、猪、人流感病毒核酸序列的新型甲型H1N1流感病毒[1-3]。
辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)为第三代腺病毒载体，具有安全、高效、转移容量大和持续表达等特点，常用于基因治疗研究[4]。国外已有报道HDAd用于疫苗研究时，能诱导机体产生更强的针对转基因的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)及抗体应答能力[5]。本课题组通过滴鼻途径免疫小鼠也获得了类似的结果，证实HDAd黏膜疫苗能诱导机体产生更好的转基因免疫效果，不良反应有所减轻[6]。
本研究以HDAd为基础，构建可表达新型甲型H1N1流感病毒HA 抗原的辅助病毒依赖型重组腺病毒载体HDAd/HA，为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株与细胞
HDAd Cre/loxP系统及辅助病毒H14、293Cre4细胞均购自加拿大Microbix公司，pSC15BMBESacⅡ由石长信博士构建[7]，质粒pSC11-CMV、293细胞、E.coli DH5α、E.coli DH10B菌株由本实验室保存。
1.2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶PmeⅠ、I-SceⅠ和I-CeuⅠ购自New England Biolabs公司；其他限制性内切酶、GeneRulermarkerTM 1 kb marker 购自Fermentas公司，Ex Taq DNA聚合酶、DL15000 marker、DL2000 marker购自大连Takara公司；引物由上海生工生物有限公司合成。
1.3 甲型H1N1流感病毒HA全基因合成
根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株(A/California/07/2009(H1N1))(GenBank FJ969540.1)基因序列，采用全基因合成的方法合成HA基因，委托上海生工生物有限公司完成，克隆载体为pUC57，以EcoRⅠ和SmaⅠ插入合成基因。
1.4 HDAd重组质粒pSC15B/HA的构建
1.4.1 pSC11/HA重组质粒的构建
以EcoRⅠ和SmaⅠ分别双酶切重组质粒pUC57/HA和穿梭质粒pSC11-CMV，分别回收HA目的基因和线性化的pSC11-CMV载体片段，连接，转化E.coli DH5α感受态细菌。挑取单菌落接种液体培养基，小量提取质粒，EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切鉴定。重组质粒命名为pSC11/HA。
1.4.2 HDAd重组质粒pSC15B/HA的构建
用I-SceⅠ和I-CeuⅠ分别双酶切pSC11/HA和pSC15BMBESacⅡ，回收HA基因片段及载体pSC15BMBESacⅡ，连接，转化感受态细菌E.coli DH10B，挑取单菌落接种液体培养基，小量提取质粒，分别用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、XhoⅠ和NheⅠ进行酶切鉴定，获得的重组体命名为pSC15B/HA。
1.5 HDAd/HA重组腺病毒载体的获得、大量制备及纯化
Pme Ⅰ酶切消化pSC15B/HA重组质粒，去除其原核复制元件及抗性基因，获得HDAd/HA DNA分子。常规培养293Cre4细胞，以磷酸钙共沉淀法进行转染。次日加入辅助病毒H14，培养2~3 d后，收集病变的细胞及上清，水平离心，留取少量上清及沉淀，重悬，于-70 ℃充分冷冻后取出，以37 ℃水浴快速融化，如此反复冻融3次，使细胞膜裂解，病毒颗粒充分释放，获得的HDAd/HA载体粗提液，以1 mL/管分装入无菌的1.5 mL EP管中，-70 ℃保存备用。取上述1管接种293Cre4细胞，加入辅助病毒，上述同样操作方法处理，直至获得第6~7代HDAd/HA载体粗提液，进行大量培养收获。以CsCl密度梯度及等密度梯度法超速离心纯化收获的HDAd/HA载体两次，全部转移到Slide-A-Lyzer透析盒中，4 ℃，24 h，所用透析液体为10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。透析完成后小心取出载体至无菌Ep管中，加入甘油，-70 ℃保存。详细操作步骤及条件请见参考文献[8-9]。
测定纯化重组腺病毒载体HDAd/HA的OD260的值，计算其病毒颗粒(virus particle,vp)浓度。
1.6 HDAd/HA电镜观察
用电镜铜网放入纯化后的HDAd/HA中约1 min，将铜网取出后在1%的磷钨酸中染色约1 min，电镜观察。加速电压80 kV，通过CCD数码相机进行观察、拍照记录。
1.7 RT-PCR鉴定
培养293细胞，待丰度达到70%~90%，取HDAd/HA载体与辅助病毒共感染293细胞，培养2~3 d，Trizol法提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书操作获得cDNA模板，并进行HA的PCR扩增。引物设计根据HA基因合成序列，上游引物(nt5-nt28)5′-tgaaggcaatactagtagttctgc-3′，下游引物(nt796-nt819)5′-gaatgcatatctcggtaccactag-3′，预扩增条带约为820 bp。反应条件为94 ℃，3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃，1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。同时用总RNA为模板行PCR作为阴性对照。
2 结果
2.1 HA基因合成与重组质粒的鉴定
甲型H1N1流感病毒HA蛋白编码基因长度为1 701个核苷酸，经比对，上海生工生物有限公司所合成序列与预期HA基因序列完全吻合(序列报告图略)。HA基因的上下游分别引入了EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点，并以此分别克隆入pUC57载体及pSC11-CMV穿梭载体，因此以EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切pUC57/HA和pSC11/HA重组质粒，均应得到约1 700 bp条带。琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符(见图 1)。pSC15B/HA重组质粒分别用XhoⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、BamHⅠ单酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，结果均与预期一致(图略)。
图1
pSC11/HA和pUC57/HA酶切鉴定
1: DL15000 marker； 2:
1: DL15000 marker; 2: pSC11/HA digested by
2.2 纯化的HDAd/HA载体浓度计算[8 ]
病毒颗粒浓度计算公式为：病毒颗粒浓度(vp/mL)=OD260值×稀释倍数×1.1×1012×36÷HDAd/HA碱基数(kb)。用含0.1% SDS的TE溶液将纯化后的HDAd/HA载体稀释10倍，测得OD260值为0.147，HDAd/HA碱基数约为34.09 kb，计算HDAd/HA的病毒颗粒浓度为：0.147×10×1.1×1012×36÷34.09≈1.7×1012 vp/mL。
2.3 HDAd/HA的电镜观察结果
透射电镜下观察HDAd/HA载体，其颗粒略呈二十面体结构，直径约70 nm，属较为典型的腺病毒形态，未见有其它病毒、支原体、细菌和真菌污染(见图 2)。
图2
纯化的HDAd/HA的电镜下形态(JEM-1400)
Figure2.
Purified HDAd/HA under transmission electron microscope (JEM-1400)
2.4 RT-PCR检测HA基因的转录
RT-PCR检测显示，HDAd/HA载体与辅助病毒共感染的293细胞阳性实验组可见到约800 bp的DNA条带，未感染的293细胞阴性对照组未见，说明前者中HA基因有转录(见图 3)。
图3
RT-PCR鉴定HA蛋白基因的转录
1： PCR扩增细胞总RNA(阴性对照)；2： RT-PCR 结果；3： DL2000 marker
Figure3. HA gene transcription confirmed by RT-PCR1: PCR result of total RNA (negative control)； 2: product of RT-PCR； 3: DL2000 marker
3 讨论
利用传统的鸡胚方法制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在我国已进入临床应用，但因病毒在鸡胚中复制效果差导致的疫苗产量不足及病毒变异等问题，难以及时、大规模生产来满足大量易感人群使用的疫苗。同时，随着人类感染甲型H1N1流感病毒持续增加，病毒发生抗原漂移(drift)和抗原转变(shift)的可能性也会随之增加，由抗原变异产生的新毒株，一方面会导致更高的发病率和死亡率，另一方面也会降低现有疫苗的保护效率。因此，针对变异的毒株，能在短期内迅速更新换代并完成大量制备的流感疫苗显然具有更大的优势[10]。
大量动物实验表明，包括质粒和病毒载体等在内的重组DNA疫苗不仅能有效诱导机体产生体液和细胞免疫，而且能预防多种人类疾病。其中第一代非复制型腺病毒载体(first generation replication deficient recombinant adenoviral vector,FGAd)表达高致病性禽流感病毒HA的重组腺病毒显示出高效的免疫保护作用[11]。经黏膜途径应用的FGAd疫苗，具有从头合成(de novo synthesis)能力，经黏膜应用时，可诱导机体产生的系统及黏膜体液免疫和细胞免疫应答，不仅能同时预防感染和保护下呼吸道，而且细胞免疫还是有效避免疾病增强作用的重要因素，国内外已有报道利用FGAd构建可表达甲型H1N1流感病毒HA蛋白或NA蛋白，开展免疫原性及免疫保护作用的研究[10, 12]。
HDAd是在第一、第二代腺病毒载体的基础上研制的一种全缺失腺病毒载体，又称空壳载体。由于缺乏所有腺病毒编码基因，仅含有腺病毒复制信号(inverted terminal repeats，ITRs)和包装信号(Ψ)，其复制和包装需要辅助病毒为其提供所需的全部蛋白。HDAd不仅继承了传统腺病毒载体稳定、滴度高、低致病性等优点，并且由于其不表达自身蛋白，极大地降低了细胞毒性和免疫原性，因此比FGAd更安全，表达目的基因持续时间长；HDAd外源基因容纳量达36 kb，可同时表达多个基因，具有包装容量大、更高效等特点。HDAd作为疫苗载体的研究起步较晚。本课题组对HDAd和FGAd载体进行实验研究发现，以HDAd/EGFP 感染早期的A549细胞，较FGAd/EGFP 有更高的荧光表达率及更高的表达强度，显示HDAd 载体具有转基因瞬时高表达的特性，是一种更有价值的疫苗载体[8]。
为提高HA的转录和翻译水平，在进行基因合成时，我们对HA基因进行了适当改造，在其5′端增加了GCCACC，并使用了双起始密码子，即在原有的atg之后，增加了缬氨酸密码子gtg，形成了完整的Kozak序列GCCACCATGG。在HA的3′端使用了双终止密码子。
本研究应用HDAd载体系统，将人工合成的新型甲型H1N1流感病毒的HA基因插入到辅助病毒依赖型腺病毒的骨架质粒上，成功完成了HDAd/HA相关质粒的构建、制备及纯化的过程，并以HDAd/HA DNA分子转染293cre4细胞，与辅助病毒共同包装出含有HA基因的HDAd/HA重组腺病毒载体，电镜观察具有典型的腺病毒形态。通过体外感染293细胞，RT-PCR检测显示其在正常的哺乳动物细胞中能实现HA基因的正常转录，为以HDAd载体系统表达HA蛋白，通过滴鼻途径开展体内免疫学效果和免疫保护研究奠定了初步基础。
引言
甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，可使病毒获得感染性，并能刺激机体产生特异性中和抗体，在抗病毒感染中发挥重要作用。HA是流感病毒基因组第四节段的产物，很容易变异。2009年在墨西哥首先出现的甲型H1Nl流感，很快出现世界范围内的人与人之间的广泛传播。进化分析显示此次病原体为发生基因重排的，同时含禽、猪、人流感病毒核酸序列的新型甲型H1N1流感病毒[1-3]。
辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)为第三代腺病毒载体，具有安全、高效、转移容量大和持续表达等特点，常用于基因治疗研究[4]。国外已有报道HDAd用于疫苗研究时，能诱导机体产生更强的针对转基因的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)及抗体应答能力[5]。本课题组通过滴鼻途径免疫小鼠也获得了类似的结果，证实HDAd黏膜疫苗能诱导机体产生更好的转基因免疫效果，不良反应有所减轻[6]。
本研究以HDAd为基础，构建可表达新型甲型H1N1流感病毒HA 抗原的辅助病毒依赖型重组腺病毒载体HDAd/HA，为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株与细胞
HDAd Cre/loxP系统及辅助病毒H14、293Cre4细胞均购自加拿大Microbix公司，pSC15BMBESacⅡ由石长信博士构建[7]，质粒pSC11-CMV、293细胞、E.coli DH5α、E.coli DH10B菌株由本实验室保存。
1.2 工具酶及主要试剂
限制性内切酶PmeⅠ、I-SceⅠ和I-CeuⅠ购自New England Biolabs公司；其他限制性内切酶、GeneRulermarkerTM 1 kb marker 购自Fermentas公司，Ex Taq DNA聚合酶、DL15000 marker、DL2000 marker购自大连Takara公司；引物由上海生工生物有限公司合成。
1.3 甲型H1N1流感病毒HA全基因合成
根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株(A/California/07/2009(H1N1))(GenBank FJ969540.1)基因序列，采用全基因合成的方法合成HA基因，委托上海生工生物有限公司完成，克隆载体为pUC57，以EcoRⅠ和SmaⅠ插入合成基因。
1.4 HDAd重组质粒pSC15B/HA的构建
1.4.1 pSC11/HA重组质粒的构建
以EcoRⅠ和SmaⅠ分别双酶切重组质粒pUC57/HA和穿梭质粒pSC11-CMV，分别回收HA目的基因和线性化的pSC11-CMV载体片段，连接，转化E.coli DH5α感受态细菌。挑取单菌落接种液体培养基，小量提取质粒，EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切鉴定。重组质粒命名为pSC11/HA。
1.4.2 HDAd重组质粒pSC15B/HA的构建
用I-SceⅠ和I-CeuⅠ分别双酶切pSC11/HA和pSC15BMBESacⅡ，回收HA基因片段及载体pSC15BMBESacⅡ，连接，转化感受态细菌E.coli DH10B，挑取单菌落接种液体培养基，小量提取质粒，分别用BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、XhoⅠ和NheⅠ进行酶切鉴定，获得的重组体命名为pSC15B/HA。
1.5 HDAd/HA重组腺病毒载体的获得、大量制备及纯化
Pme Ⅰ酶切消化pSC15B/HA重组质粒，去除其原核复制元件及抗性基因，获得HDAd/HA DNA分子。常规培养293Cre4细胞，以磷酸钙共沉淀法进行转染。次日加入辅助病毒H14，培养2~3 d后，收集病变的细胞及上清，水平离心，留取少量上清及沉淀，重悬，于-70 ℃充分冷冻后取出，以37 ℃水浴快速融化，如此反复冻融3次，使细胞膜裂解，病毒颗粒充分释放，获得的HDAd/HA载体粗提液，以1 mL/管分装入无菌的1.5 mL EP管中，-70 ℃保存备用。取上述1管接种293Cre4细胞，加入辅助病毒，上述同样操作方法处理，直至获得第6~7代HDAd/HA载体粗提液，进行大量培养收获。以CsCl密度梯度及等密度梯度法超速离心纯化收获的HDAd/HA载体两次，全部转移到Slide-A-Lyzer透析盒中，4 ℃，24 h，所用透析液体为10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。透析完成后小心取出载体至无菌Ep管中，加入甘油，-70 ℃保存。详细操作步骤及条件请见参考文献[8-9]。
测定纯化重组腺病毒载体HDAd/HA的OD260的值，计算其病毒颗粒(virus particle,vp)浓度。
1.6 HDAd/HA电镜观察
用电镜铜网放入纯化后的HDAd/HA中约1 min，将铜网取出后在1%的磷钨酸中染色约1 min，电镜观察。加速电压80 kV，通过CCD数码相机进行观察、拍照记录。
1.7 RT-PCR鉴定
培养293细胞，待丰度达到70%~90%，取HDAd/HA载体与辅助病毒共感染293细胞，培养2~3 d，Trizol法提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书操作获得cDNA模板，并进行HA的PCR扩增。引物设计根据HA基因合成序列，上游引物(nt5-nt28)5′-tgaaggcaatactagtagttctgc-3′，下游引物(nt796-nt819)5′-gaatgcatatctcggtaccactag-3′，预扩增条带约为820 bp。反应条件为94 ℃，3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃，1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。同时用总RNA为模板行PCR作为阴性对照。
2 结果
2.1 HA基因合成与重组质粒的鉴定
甲型H1N1流感病毒HA蛋白编码基因长度为1 701个核苷酸，经比对，上海生工生物有限公司所合成序列与预期HA基因序列完全吻合(序列报告图略)。HA基因的上下游分别引入了EcoRⅠ和SmaⅠ酶切位点，并以此分别克隆入pUC57载体及pSC11-CMV穿梭载体，因此以EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切pUC57/HA和pSC11/HA重组质粒，均应得到约1 700 bp条带。琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符(见图 1)。pSC15B/HA重组质粒分别用XhoⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、EcoR Ⅴ、BamHⅠ单酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，结果均与预期一致(图略)。
图1
pSC11/HA和pUC57/HA酶切鉴定
1: DL15000 marker； 2:
1: DL15000 marker; 2: pSC11/HA digested by
2.2 纯化的HDAd/HA载体浓度计算[8 ]
病毒颗粒浓度计算公式为：病毒颗粒浓度(vp/mL)=OD260值×稀释倍数×1.1×1012×36÷HDAd/HA碱基数(kb)。用含0.1% SDS的TE溶液将纯化后的HDAd/HA载体稀释10倍，测得OD260值为0.147，HDAd/HA碱基数约为34.09 kb，计算HDAd/HA的病毒颗粒浓度为：0.147×10×1.1×1012×36÷34.09≈1.7×1012 vp/mL。
2.3 HDAd/HA的电镜观察结果
透射电镜下观察HDAd/HA载体，其颗粒略呈二十面体结构，直径约70 nm，属较为典型的腺病毒形态，未见有其它病毒、支原体、细菌和真菌污染(见图 2)。
图2
纯化的HDAd/HA的电镜下形态(JEM-1400)
Figure2.
Purified HDAd/HA under transmission electron microscope (JEM-1400)
2.4 RT-PCR检测HA基因的转录
RT-PCR检测显示，HDAd/HA载体与辅助病毒共感染的293细胞阳性实验组可见到约800 bp的DNA条带，未感染的293细胞阴性对照组未见，说明前者中HA基因有转录(见图 3)。
图3
RT-PCR鉴定HA蛋白基因的转录
1： PCR扩增细胞总RNA(阴性对照)；2： RT-PCR 结果；3： DL2000 marker
Figure3. HA gene transcription confirmed by RT-PCR1: PCR result of total RNA (negative control)； 2: product of RT-PCR； 3: DL2000 marker
3 讨论
利用传统的鸡胚方法制备的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗在我国已进入临床应用，但因病毒在鸡胚中复制效果差导致的疫苗产量不足及病毒变异等问题，难以及时、大规模生产来满足大量易感人群使用的疫苗。同时，随着人类感染甲型H1N1流感病毒持续增加，病毒发生抗原漂移(drift)和抗原转变(shift)的可能性也会随之增加，由抗原变异产生的新毒株，一方面会导致更高的发病率和死亡率，另一方面也会降低现有疫苗的保护效率。因此，针对变异的毒株，能在短期内迅速更新换代并完成大量制备的流感疫苗显然具有更大的优势[10]。
大量动物实验表明，包括质粒和病毒载体等在内的重组DNA疫苗不仅能有效诱导机体产生体液和细胞免疫，而且能预防多种人类疾病。其中第一代非复制型腺病毒载体(first generation replication deficient recombinant adenoviral vector,FGAd)表达高致病性禽流感病毒HA的重组腺病毒显示出高效的免疫保护作用[11]。经黏膜途径应用的FGAd疫苗，具有从头合成(de novo synthesis)能力，经黏膜应用时，可诱导机体产生的系统及黏膜体液免疫和细胞免疫应答，不仅能同时预防感染和保护下呼吸道，而且细胞免疫还是有效避免疾病增强作用的重要因素，国内外已有报道利用FGAd构建可表达甲型H1N1流感病毒HA蛋白或NA蛋白，开展免疫原性及免疫保护作用的研究[10, 12]。
HDAd是在第一、第二代腺病毒载体的基础上研制的一种全缺失腺病毒载体，又称空壳载体。由于缺乏所有腺病毒编码基因，仅含有腺病毒复制信号(inverted terminal repeats，ITRs)和包装信号(Ψ)，其复制和包装需要辅助病毒为其提供所需的全部蛋白。HDAd不仅继承了传统腺病毒载体稳定、滴度高、低致病性等优点，并且由于其不表达自身蛋白，极大地降低了细胞毒性和免疫原性，因此比FGAd更安全，表达目的基因持续时间长；HDAd外源基因容纳量达36 kb，可同时表达多个基因，具有包装容量大、更高效等特点。HDAd作为疫苗载体的研究起步较晚。本课题组对HDAd和FGAd载体进行实验研究发现，以HDAd/EGFP 感染早期的A549细胞，较FGAd/EGFP 有更高的荧光表达率及更高的表达强度，显示HDAd 载体具有转基因瞬时高表达的特性，是一种更有价值的疫苗载体[8]。
为提高HA的转录和翻译水平，在进行基因合成时，我们对HA基因进行了适当改造，在其5′端增加了GCCACC，并使用了双起始密码子，即在原有的atg之后，增加了缬氨酸密码子gtg，形成了完整的Kozak序列GCCACCATGG。在HA的3′端使用了双终止密码子。
本研究应用HDAd载体系统，将人工合成的新型甲型H1N1流感病毒的HA基因插入到辅助病毒依赖型腺病毒的骨架质粒上，成功完成了HDAd/HA相关质粒的构建、制备及纯化的过程，并以HDAd/HA DNA分子转染293cre4细胞，与辅助病毒共同包装出含有HA基因的HDAd/HA重组腺病毒载体，电镜观察具有典型的腺病毒形态。通过体外感染293细胞，RT-PCR检测显示其在正常的哺乳动物细胞中能实现HA基因的正常转录，为以HDAd载体系统表达HA蛋白，通过滴鼻途径开展体内免疫学效果和免疫保护研究奠定了初步基础。
