DNA甲基化、组蛋白转录后修饰、非编码RNA调节等表观遗传修饰是环境刺激引起的可逆、可遗传改变。高糖血症、氧化应激、糖基化终产物等导致糖尿病及其并发症发生发展的主要刺激因素均能导致视网膜血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞内异常基因表观遗传修饰。异常基因表观遗传修饰在糖尿病视网膜病变(DR)黄斑水肿、新生血管形成等病理过程发挥重要作用；引起的代谢记忆现象导致即便血糖控制，DR等糖尿病并发症仍将进一步进展。表观遗传改变还能代代相传，在家族性糖尿病形成中发挥重要作用。深入探讨表观遗传修饰对DR发生发展的影响可为DR预防治疗提供新的思路。
引用本文： 陈文文, 常青. 糖尿病视网膜病变表观遗传修饰的作用研究进展. 中华眼底病杂志, 2016, 32(2): 213-217. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.026 复制
糖尿病视网膜病变(DR)的发生发展是基因和环境因素共同作用的结果。大规模前瞻性研究显示，早期严格控制血糖对预防糖尿病并发症具有重要作用[1-3]。一段时间未有效控制血糖后，即便其后血糖能有效控制，糖尿病并发症仍将进一步进展，即代谢记忆现象[4, 5]。代谢记忆现象对糖尿病并发症的控制和治疗造成很大困难。已有大量研究结果显示，表观遗传修饰是环境与基因之间相互作用的关键因素，且长期的表观遗传改变是代谢记忆现象产生的机制之一[6]。在DNA序列不发生改变的情况下，通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调节等调控模式，致使基因表达和功能发生改变并产生可遗传的表型为表观遗传学核心观点[7, 8]。表观遗传修饰不仅能使细胞和组织对环境刺激迅速做出反应，还能在刺激结束后仍保留记忆[9]。高血糖、氧化应激、糖基化终产物(AGEs)等导致糖尿病及其并发症发生发展的主要因素均能引起异常调节的表观遗传改变[10]，出现视网膜血管内皮细胞(REC)、视网膜色素上皮(RPE)细胞内染色质顺式和反式作用因子、线粒体DNA、组蛋白、非编码RNA等的表观遗传修饰[5, 11-13]。这些表观遗传修饰可造成REC的异常基因表达，在DR的黄斑水肿和新生血管形成等病理过程起到重要作用[14]。表观遗传改变还能代代相传，在家族性糖尿病形成中发挥重要作用[15, 16]。人类全基因组测序计划提供了正常和疾病状态下染色体状态、表观遗传改变等大量信息[17]，为进一步理解DR发病机制提供了帮助。现有的DR治疗方式仍存在一系列问题。因此，对表观遗传修饰作用的研究不仅是对DR发病机制新的认识，也为DR的治疗提供新的治疗靶点，具有重要意义。
1 DR的表观遗传修饰
1.1 DNA甲基化
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基化的供体，将甲基基团转移到胞嘧啶的5′碳位，形成5′甲基胞嘧啶[18]。哺乳动物甲基化主要发生在双核苷酸(CpG)的胞嘧啶上，CpG岛常位于转录调控区附近，其异常甲基化会改变DNA与蛋白之间的相互作用，导致基因沉默或激活和蛋白表达变化[18, 19]。甲基化的效应随基因组内容的不同而不同[20]。
DNA甲基化是重要的表观遗传修饰形式。糖尿病初级阶段即有全基因组DNA甲基化的修饰，且DR患者全基因组甲基化水平远高于非DR患者的对照组[21]。对患有1型糖尿病(T1D)的增生型DR(PDR)患者全基因组DNA甲基化水平分析发现，79%位点出现DNA甲基化水平的降低，21%的位点出现甲基化水平增高[22]。位点所在基因与视网膜功能、糖尿病并发症、炎症反应、氧化应激等相关[22]。提示DNA 甲基化机制在DR的发展中起重要作用，但甲基化位点的具体作用仍需进一步研究。此外，前瞻性队列研究发现某些位点的甲基化水平还可作为T1D患者PDR发生的预测指标[22]。除染色质DNA外，Kowluru[11]研究发现，DR线粒体结构、功能及mtDNA均有损伤。mtDNA 损伤导致线粒体蛋白减少，电子转运系统功能障碍。这些由糖尿病引起的线粒体功能障碍，即使在血糖控制 后仍存在，形成代谢记忆现象。高糖环境下，线粒体中聚合酶γ1 (POLG1)启动子及调节区CpG岛高甲基化，导致POLG1 水平持续下调且影响POLG1与mtDNA的结合，最终导致mtDNA转录异常，影响线粒体功能[23]。通过药学或分子途径调节DNA甲基化水平，能帮助维持线粒体稳态，阻止DR的进一步进展。
1.2 组蛋白修饰
组蛋白的修饰水平受组蛋白修饰相关酶类和去特异性修饰相关酶类的活性调节[24]。在高糖处理REC以及DR动物模型标本中，均发现有组蛋白转录后修饰[6]。
1.2.1 组蛋白甲基化
组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3和H4的精氨酸或赖氨酸残基上，由组蛋白甲基转移酶和脱甲基酶调节[25]。表观遗传研究表明，特定细胞中稳定的组蛋白甲基化修饰对维持个体健康非常重要[16]。目前发现的激活标记有H3K4、H3K36、H3K79等，抑制标记有H3K9、H3K27、 H4K20等[17, 26, 27]。
高糖引起的超氧化物歧化酶(SOD2)mRNA的抑制以及随之而来的REC内氧化应激增加是糖尿病并发症发生的关键因素。而SOD2的表达减少与其基因上组蛋白修饰息息相关。高糖能降低SOD2组蛋白上活性标记H3K4单甲基化(H3K4me1)、H3K4me2水平，增加组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)在SOD2上的结合[28, 29]。同时能增加抑制性标记物H4K20me3水平，增加H3K9、核转录因子(NF-κB) p65与H4K20me3之间的相互作用，同样导致SOD2表达的减弱[29]。此外，高糖能降低REC中基质金属蛋白酶9(MMP-9)启动子处抑制性标记物H3K9me2水平，最终促进MMP-9活性，导致线粒体损伤和细胞凋亡[30]。精氨酸甲基转化酶1(CARM1) 在高糖处理过的人RPE细胞系ARPE-19 及糖尿病小鼠RPE层中增加，促进RPE细胞的凋亡[12]。
高糖环境下，REC中Set7蛋白甲基转移酶(PRMT)在核仁处聚集。PRMT能通过H3K4me1依赖和非依赖途径调节糖诱导的染色质改变和基因表达。提示Set7与高糖处理过后持续的血管基因表达有关并可能是高糖记忆现象分子机制之一[31]。
氧化应激也能刺激DR进展。Gclc是谷胱甘肽(GSH)生成过程中一种重要酶，其表达受核因子E2相关因子(Nrf2) 调节。DR发展过程中，Gclc抗氧化因子区域4(ARE4)的H3K4me1水平降低，导致Nrf2与其结合减少，最终Gclc表达水平下降。因此，DR中Gclc-ARE4的组蛋白甲基化水平对调节Nrf2-Gclc-GSH反应起重要作用[32]。此外，高糖环境下，Set7/9 (SetD7)活性增加，也可通过增加Keap1启动子组蛋白H3K4me1，增加Keap1表达而抑制Nrf2的抗氧化功能[33]。
1.2.2 组蛋白乙酰化
组蛋白乙酰化水平受去乙酰化酶(HDAC) 、抗衰老酶和乙酰基转移酶调控。组蛋白乙酰化的位点基本为基因启动子的转录活性位点，如 H3K9ac、H3K14ac、H4K8Ac、H4K12Ac、H4K5ac等，对基因表达有重要影响[6]。
一项长期糖尿病干预和并发症流行病学调查(EDIC)研究显示，DR患者血单核细胞中有大量的启动子组蛋白H3K9被乙酰化[34]。全基因组范围内人REC中组蛋白H3K9/K14ac和DNA甲基化图谱提示，高糖诱导的H3K9/K14ac与CpG甲基化负相关作用是引起REC功能失调的机制之一[35]。组蛋白 H3K9的乙酰化还能调节REC硫氧还原反应蛋白(TXNIP)所介导的炎症反应。高糖血症能促进乙酰基转移酶 p300与TXNIP启动子的结合，使其组蛋白H4乙酰化，刺激TXNIP的表达，进一步诱导环氧化酶2表达[36]。即使小鼠保持在血糖控制不良的情况下，抑制TXNIP活性仍能阻止糖尿病进展。提示TXNIP 在DR的表观遗传改变和代谢记忆中起重要作用。
动物实验中，高糖能降低抗衰老酶1(Sirt1)活性并增加 p65 乙酰化，从而活化MMP-9，造成线粒体损伤和细胞凋亡。野生型糖尿病大鼠及DR患者视网膜会出现类似的Sirt1减少，SOD2的过表达等现象[37]。此外多项研究均达成共识，H2O2也会使Sirt1 减少，造成MMP-9显著增加。提示氧化应激在DR进展中起关键作用[37-39]。
1.3 非编码RNA
已有研究证实，从哺乳动物基因组转录而来的RNA中，有很大一部分序列不编码蛋白，即非编码RNA[40]。其作为糖尿病并发症表观遗传的调节机制之一，已引起广泛的关注。
微小RNA(miRNA)是长度约20～22核苷酸的小片段非编码RNA，在哺乳动物基因转录后加工过程中通过与特异性RNA结合，诱导其降解或抑制翻译等途径使基因沉默[41]。越来越多研究证实，多种miRNA能与DR相关因子结合，影响DR进展。视网膜神经节细胞和内核层细胞中的miR-29在糖尿病早期被上调，具有防止视网膜细胞凋亡的作用[42]。而miR-200b水平下降[43]，miR-200b类似物在体内、体外作用均能抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，缓解糖诱导产生的VEGF水平增高[43]，DR中VEGF水平增高可能与其表达下降有关。Kovacs等[44]分析DR早期大鼠的REC miRNA表达谱发现，对NF-κB、VEGF、p53敏感的miRNAs，包括miR-146、miR-155、miR-132、miR-21，尤其是miR-34家族的表达上调。但也有学者在T1D大鼠的视网膜中发现miR-146a水平下降，通过玻璃体内注射miR-146a类似物证实miR-146a能直接调节纤连蛋白的表达，其下调能导致胞外基质蛋白产物增加最终引起DR中的纤维变性[45]。结果的不同可能与DR的时期不同有关，但仍需严谨的对照研究进一步解释。由于miRNA在血清中稳定存在，可作为糖尿病并发症临床研究队列中一项珍贵的生物学指标，用于糖尿病并发症的早期发现或临床随访[6]。
长非编码RNA(lncRNAs)指长度超过200核苷酸片段的非编码RNA，通过调节染色质复合体的修饰或与转录因子相互作用或作为miRNA的宿主而发挥功能[46]。lncRNA能够调节β细胞的功能，可能是糖尿病的发病机制之一[47]。在血管平滑肌细胞(VSMC)中，lncRNA受血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)调节，通过影响miRNA产生调节VSMC的增生[48]。提示lncRNA在糖尿病血管并发症发展中可能起作用。目前lncRNAs与DR关系的研究不多，但在糖尿病肾病的研究中已取得一些突破[6, 49]，可作为参考进一步研究。
2 表观遗传修饰与DR代谢记忆和治疗
高糖血、氧化应激、AGEs均可刺激细胞产生表观遗传改变。高糖影响组织代谢，产生各种生长因子，如AngⅡ、转化生长因子-β等，这些生长因子激活胞内信号通路，与表观遗传网络联系，引起染色质重塑，影响细胞功能[6]。氧化应激存在于机体正常活动中，而糖尿病可导致机体氧化应激失衡。活性氧能直接损伤核酸、蛋白、脂质等大分子物质，导致基因表达的异常、酶功能障碍和细胞膜损伤等，持续的损伤可引起靶细胞基因包括线粒体基因组表观遗传修饰，最终对细胞产生持久性的破坏[50]。Kowluru等[50]已对氧化应激引起的靶细胞表观遗传改变做了系统而详细的研究。氧化应激异常可引起AGEs累积[50]。AGEs通过影响NF-κB等多条细胞通路或与大分子物质直接作用，导致毛细血管细胞凋亡、破坏血视网膜屏障等[51]。多项长期临床研究显示，AGEs与DR代谢记忆的发生有紧密联系[52, 53]。同时活性氧也是AGEs形成的副产物，AGEs也可反过来刺激氧化应激反应，形成恶性循环。
大规模1、2型糖尿病临床试验显示，早期严格控制血糖能减少DR发生率，减缓其进展，但即使血糖控制，糖尿病血管并发症仍持续存在[54]。链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖控制不良3～6个月后，REC中HDAC-1、HDAC-2和HDAC-8表达增加，而组蛋白H3特异性的乙酰基转移酶活性下降，这些改变在小鼠血糖控制正常6个月后仍不能逆转[55]。这一现象已被多项研究结果证实，提示代谢记忆现象存在[28]。糖尿病控制和并发症研究/EDIC研究显示，早期严格控制血糖组DR发生率与对照组比较显著下降，且此差异10年后仍存在，提示代谢记忆在糖尿病早期就已形成，且对糖尿病并发症的产生进展有深远影响[2, 56]。
代谢记忆的存在使糖尿病并发症的治疗难度更大，使个体对口服抗糖尿病药物的反应存在较大差异[57]，且其可遗传的特点可使下一代更易出现代谢障碍[58]，值得关注。但表观遗传修饰的可逆性为研究早期干预，纠正不良代谢记忆提供了科学基础，是潜在的治疗靶点[29]。DNA启动子、CpG岛等高甲基化位点，组蛋白甲基化、乙酰化位点等均为临床药物的潜在靶点，通过miRNA减少一些酶如LSD1、MMP-9、CARM1等的表达和活性可能可以减少细胞凋亡，减缓DR进展[12]。此外，一些在高糖环境中被下调的具有保护作用的miRNA如miR-146a、miR-29b、 miR-200b等，以及被上调的miRNA如miR-155、miR-132、miR-21等，其类似物或抑制剂都有很高的应用前景，但其脱靶效应将会成为巨大挑战[13]。
药物的研究也在逐步进行中。5-硫唑嘌呤-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素A能提高人REC和RPE细胞中的色素上皮衍生因子(PEDF)水平和PEDF/VEGF的比率，减轻高糖刺激副作用[59]。丙戊酸治疗可以增加缺血性视网膜内的H3ac，降低应激反应蛋白、葡萄糖调节蛋白78/BiP 和CAAT区增强子结合蛋白同源蛋白以及细胞凋亡蛋白酶-12的活性[60]。白藜芦醇能促进视网膜中Sirt1的表达从而阻止p65乙酰化，抑制视网膜的细胞凋亡[61]。siRNA PF-04523655可以通过RNA干扰抑制低氧诱导基因的表达，可用于DR治疗[62]。此外一些经过锁定核酸修饰的抗miRNA如抗miR-192具有高度特异性和有效性，除miR-192表达水平外，其下游miRNA如miR-216a、miR-217、miR-200家族以及p53水平也被下调，提示抗miRNA将成为DR治疗中的重要途径。且有学者提出，miRNA扩增与遗传变异的知识相结合，将对DR个体化用药的实现提供帮助[16]。
表观遗传修饰位点作为抗DR药物具有很好的前景。但也有研究认为，在终末分化细胞如神经细胞、RPE细胞等，表观遗传改变不易逆转[63]。
3 展望
表观遗传修饰对DR发病的可能机制研究及治疗提供了新的方向，但进一步探讨仍是巨大挑战。除DR外，表观遗传修饰在糖尿病其他血管并发症，如心血管、肾脏疾病等的进展中也起到很大作用，且这些方向的研究也已取得了一定进展[13, 64-66]，对DR的机制研究具有一定借鉴参考意义。DNA甲基化，组蛋白转录后修饰，ncRNA之间的相互作用也是表观遗传调控基因表达的一种方式[67]，有很大的研究空间。曾有文献报道，锻炼可以对糖尿病表观遗传的改变产生有利影响[68]，进一步探讨生活方式的改变是否能改变DR相关表观遗传改变非常有意义。通过大样本对照研究分析表观遗传改变在DR不同时期及病变程度时起的作用对DR的发病机制及治疗也有很大帮助。另外，新技术如下一代基因测序技术[10]的发展及人类全基因组测序计划的实施等对表观遗传机制的进一步研究提供较大帮助。但如何对这些大量的生物学数据进行分析，建立计算机模型是一个不小的难题。若能充分利用大数据的信息，将有助于对糖尿病及其并发症发病机制、病理变化有更深入的了解并有利于新的靶向药物开发，同时对个体化用药也具有指导作用[16]。
糖尿病视网膜病变(DR)的发生发展是基因和环境因素共同作用的结果。大规模前瞻性研究显示，早期严格控制血糖对预防糖尿病并发症具有重要作用[1-3]。一段时间未有效控制血糖后，即便其后血糖能有效控制，糖尿病并发症仍将进一步进展，即代谢记忆现象[4, 5]。代谢记忆现象对糖尿病并发症的控制和治疗造成很大困难。已有大量研究结果显示，表观遗传修饰是环境与基因之间相互作用的关键因素，且长期的表观遗传改变是代谢记忆现象产生的机制之一[6]。在DNA序列不发生改变的情况下，通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调节等调控模式，致使基因表达和功能发生改变并产生可遗传的表型为表观遗传学核心观点[7, 8]。表观遗传修饰不仅能使细胞和组织对环境刺激迅速做出反应，还能在刺激结束后仍保留记忆[9]。高血糖、氧化应激、糖基化终产物(AGEs)等导致糖尿病及其并发症发生发展的主要因素均能引起异常调节的表观遗传改变[10]，出现视网膜血管内皮细胞(REC)、视网膜色素上皮(RPE)细胞内染色质顺式和反式作用因子、线粒体DNA、组蛋白、非编码RNA等的表观遗传修饰[5, 11-13]。这些表观遗传修饰可造成REC的异常基因表达，在DR的黄斑水肿和新生血管形成等病理过程起到重要作用[14]。表观遗传改变还能代代相传，在家族性糖尿病形成中发挥重要作用[15, 16]。人类全基因组测序计划提供了正常和疾病状态下染色体状态、表观遗传改变等大量信息[17]，为进一步理解DR发病机制提供了帮助。现有的DR治疗方式仍存在一系列问题。因此，对表观遗传修饰作用的研究不仅是对DR发病机制新的认识，也为DR的治疗提供新的治疗靶点，具有重要意义。
1 DR的表观遗传修饰
1.1 DNA甲基化
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基化的供体，将甲基基团转移到胞嘧啶的5′碳位，形成5′甲基胞嘧啶[18]。哺乳动物甲基化主要发生在双核苷酸(CpG)的胞嘧啶上，CpG岛常位于转录调控区附近，其异常甲基化会改变DNA与蛋白之间的相互作用，导致基因沉默或激活和蛋白表达变化[18, 19]。甲基化的效应随基因组内容的不同而不同[20]。
DNA甲基化是重要的表观遗传修饰形式。糖尿病初级阶段即有全基因组DNA甲基化的修饰，且DR患者全基因组甲基化水平远高于非DR患者的对照组[21]。对患有1型糖尿病(T1D)的增生型DR(PDR)患者全基因组DNA甲基化水平分析发现，79%位点出现DNA甲基化水平的降低，21%的位点出现甲基化水平增高[22]。位点所在基因与视网膜功能、糖尿病并发症、炎症反应、氧化应激等相关[22]。提示DNA 甲基化机制在DR的发展中起重要作用，但甲基化位点的具体作用仍需进一步研究。此外，前瞻性队列研究发现某些位点的甲基化水平还可作为T1D患者PDR发生的预测指标[22]。除染色质DNA外，Kowluru[11]研究发现，DR线粒体结构、功能及mtDNA均有损伤。mtDNA 损伤导致线粒体蛋白减少，电子转运系统功能障碍。这些由糖尿病引起的线粒体功能障碍，即使在血糖控制 后仍存在，形成代谢记忆现象。高糖环境下，线粒体中聚合酶γ1 (POLG1)启动子及调节区CpG岛高甲基化，导致POLG1 水平持续下调且影响POLG1与mtDNA的结合，最终导致mtDNA转录异常，影响线粒体功能[23]。通过药学或分子途径调节DNA甲基化水平，能帮助维持线粒体稳态，阻止DR的进一步进展。
1.2 组蛋白修饰
组蛋白的修饰水平受组蛋白修饰相关酶类和去特异性修饰相关酶类的活性调节[24]。在高糖处理REC以及DR动物模型标本中，均发现有组蛋白转录后修饰[6]。
1.2.1 组蛋白甲基化
组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3和H4的精氨酸或赖氨酸残基上，由组蛋白甲基转移酶和脱甲基酶调节[25]。表观遗传研究表明，特定细胞中稳定的组蛋白甲基化修饰对维持个体健康非常重要[16]。目前发现的激活标记有H3K4、H3K36、H3K79等，抑制标记有H3K9、H3K27、 H4K20等[17, 26, 27]。
高糖引起的超氧化物歧化酶(SOD2)mRNA的抑制以及随之而来的REC内氧化应激增加是糖尿病并发症发生的关键因素。而SOD2的表达减少与其基因上组蛋白修饰息息相关。高糖能降低SOD2组蛋白上活性标记H3K4单甲基化(H3K4me1)、H3K4me2水平，增加组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)在SOD2上的结合[28, 29]。同时能增加抑制性标记物H4K20me3水平，增加H3K9、核转录因子(NF-κB) p65与H4K20me3之间的相互作用，同样导致SOD2表达的减弱[29]。此外，高糖能降低REC中基质金属蛋白酶9(MMP-9)启动子处抑制性标记物H3K9me2水平，最终促进MMP-9活性，导致线粒体损伤和细胞凋亡[30]。精氨酸甲基转化酶1(CARM1) 在高糖处理过的人RPE细胞系ARPE-19 及糖尿病小鼠RPE层中增加，促进RPE细胞的凋亡[12]。
高糖环境下，REC中Set7蛋白甲基转移酶(PRMT)在核仁处聚集。PRMT能通过H3K4me1依赖和非依赖途径调节糖诱导的染色质改变和基因表达。提示Set7与高糖处理过后持续的血管基因表达有关并可能是高糖记忆现象分子机制之一[31]。
氧化应激也能刺激DR进展。Gclc是谷胱甘肽(GSH)生成过程中一种重要酶，其表达受核因子E2相关因子(Nrf2) 调节。DR发展过程中，Gclc抗氧化因子区域4(ARE4)的H3K4me1水平降低，导致Nrf2与其结合减少，最终Gclc表达水平下降。因此，DR中Gclc-ARE4的组蛋白甲基化水平对调节Nrf2-Gclc-GSH反应起重要作用[32]。此外，高糖环境下，Set7/9 (SetD7)活性增加，也可通过增加Keap1启动子组蛋白H3K4me1，增加Keap1表达而抑制Nrf2的抗氧化功能[33]。
1.2.2 组蛋白乙酰化
组蛋白乙酰化水平受去乙酰化酶(HDAC) 、抗衰老酶和乙酰基转移酶调控。组蛋白乙酰化的位点基本为基因启动子的转录活性位点，如 H3K9ac、H3K14ac、H4K8Ac、H4K12Ac、H4K5ac等，对基因表达有重要影响[6]。
一项长期糖尿病干预和并发症流行病学调查(EDIC)研究显示，DR患者血单核细胞中有大量的启动子组蛋白H3K9被乙酰化[34]。全基因组范围内人REC中组蛋白H3K9/K14ac和DNA甲基化图谱提示，高糖诱导的H3K9/K14ac与CpG甲基化负相关作用是引起REC功能失调的机制之一[35]。组蛋白 H3K9的乙酰化还能调节REC硫氧还原反应蛋白(TXNIP)所介导的炎症反应。高糖血症能促进乙酰基转移酶 p300与TXNIP启动子的结合，使其组蛋白H4乙酰化，刺激TXNIP的表达，进一步诱导环氧化酶2表达[36]。即使小鼠保持在血糖控制不良的情况下，抑制TXNIP活性仍能阻止糖尿病进展。提示TXNIP 在DR的表观遗传改变和代谢记忆中起重要作用。
动物实验中，高糖能降低抗衰老酶1(Sirt1)活性并增加 p65 乙酰化，从而活化MMP-9，造成线粒体损伤和细胞凋亡。野生型糖尿病大鼠及DR患者视网膜会出现类似的Sirt1减少，SOD2的过表达等现象[37]。此外多项研究均达成共识，H2O2也会使Sirt1 减少，造成MMP-9显著增加。提示氧化应激在DR进展中起关键作用[37-39]。
1.3 非编码RNA
已有研究证实，从哺乳动物基因组转录而来的RNA中，有很大一部分序列不编码蛋白，即非编码RNA[40]。其作为糖尿病并发症表观遗传的调节机制之一，已引起广泛的关注。
微小RNA(miRNA)是长度约20～22核苷酸的小片段非编码RNA，在哺乳动物基因转录后加工过程中通过与特异性RNA结合，诱导其降解或抑制翻译等途径使基因沉默[41]。越来越多研究证实，多种miRNA能与DR相关因子结合，影响DR进展。视网膜神经节细胞和内核层细胞中的miR-29在糖尿病早期被上调，具有防止视网膜细胞凋亡的作用[42]。而miR-200b水平下降[43]，miR-200b类似物在体内、体外作用均能抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，缓解糖诱导产生的VEGF水平增高[43]，DR中VEGF水平增高可能与其表达下降有关。Kovacs等[44]分析DR早期大鼠的REC miRNA表达谱发现，对NF-κB、VEGF、p53敏感的miRNAs，包括miR-146、miR-155、miR-132、miR-21，尤其是miR-34家族的表达上调。但也有学者在T1D大鼠的视网膜中发现miR-146a水平下降，通过玻璃体内注射miR-146a类似物证实miR-146a能直接调节纤连蛋白的表达，其下调能导致胞外基质蛋白产物增加最终引起DR中的纤维变性[45]。结果的不同可能与DR的时期不同有关，但仍需严谨的对照研究进一步解释。由于miRNA在血清中稳定存在，可作为糖尿病并发症临床研究队列中一项珍贵的生物学指标，用于糖尿病并发症的早期发现或临床随访[6]。
长非编码RNA(lncRNAs)指长度超过200核苷酸片段的非编码RNA，通过调节染色质复合体的修饰或与转录因子相互作用或作为miRNA的宿主而发挥功能[46]。lncRNA能够调节β细胞的功能，可能是糖尿病的发病机制之一[47]。在血管平滑肌细胞(VSMC)中，lncRNA受血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)调节，通过影响miRNA产生调节VSMC的增生[48]。提示lncRNA在糖尿病血管并发症发展中可能起作用。目前lncRNAs与DR关系的研究不多，但在糖尿病肾病的研究中已取得一些突破[6, 49]，可作为参考进一步研究。
2 表观遗传修饰与DR代谢记忆和治疗
高糖血、氧化应激、AGEs均可刺激细胞产生表观遗传改变。高糖影响组织代谢，产生各种生长因子，如AngⅡ、转化生长因子-β等，这些生长因子激活胞内信号通路，与表观遗传网络联系，引起染色质重塑，影响细胞功能[6]。氧化应激存在于机体正常活动中，而糖尿病可导致机体氧化应激失衡。活性氧能直接损伤核酸、蛋白、脂质等大分子物质，导致基因表达的异常、酶功能障碍和细胞膜损伤等，持续的损伤可引起靶细胞基因包括线粒体基因组表观遗传修饰，最终对细胞产生持久性的破坏[50]。Kowluru等[50]已对氧化应激引起的靶细胞表观遗传改变做了系统而详细的研究。氧化应激异常可引起AGEs累积[50]。AGEs通过影响NF-κB等多条细胞通路或与大分子物质直接作用，导致毛细血管细胞凋亡、破坏血视网膜屏障等[51]。多项长期临床研究显示，AGEs与DR代谢记忆的发生有紧密联系[52, 53]。同时活性氧也是AGEs形成的副产物，AGEs也可反过来刺激氧化应激反应，形成恶性循环。
大规模1、2型糖尿病临床试验显示，早期严格控制血糖能减少DR发生率，减缓其进展，但即使血糖控制，糖尿病血管并发症仍持续存在[54]。链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖控制不良3～6个月后，REC中HDAC-1、HDAC-2和HDAC-8表达增加，而组蛋白H3特异性的乙酰基转移酶活性下降，这些改变在小鼠血糖控制正常6个月后仍不能逆转[55]。这一现象已被多项研究结果证实，提示代谢记忆现象存在[28]。糖尿病控制和并发症研究/EDIC研究显示，早期严格控制血糖组DR发生率与对照组比较显著下降，且此差异10年后仍存在，提示代谢记忆在糖尿病早期就已形成，且对糖尿病并发症的产生进展有深远影响[2, 56]。
代谢记忆的存在使糖尿病并发症的治疗难度更大，使个体对口服抗糖尿病药物的反应存在较大差异[57]，且其可遗传的特点可使下一代更易出现代谢障碍[58]，值得关注。但表观遗传修饰的可逆性为研究早期干预，纠正不良代谢记忆提供了科学基础，是潜在的治疗靶点[29]。DNA启动子、CpG岛等高甲基化位点，组蛋白甲基化、乙酰化位点等均为临床药物的潜在靶点，通过miRNA减少一些酶如LSD1、MMP-9、CARM1等的表达和活性可能可以减少细胞凋亡，减缓DR进展[12]。此外，一些在高糖环境中被下调的具有保护作用的miRNA如miR-146a、miR-29b、 miR-200b等，以及被上调的miRNA如miR-155、miR-132、miR-21等，其类似物或抑制剂都有很高的应用前景，但其脱靶效应将会成为巨大挑战[13]。
药物的研究也在逐步进行中。5-硫唑嘌呤-2-脱氧胞苷和曲古抑菌素A能提高人REC和RPE细胞中的色素上皮衍生因子(PEDF)水平和PEDF/VEGF的比率，减轻高糖刺激副作用[59]。丙戊酸治疗可以增加缺血性视网膜内的H3ac，降低应激反应蛋白、葡萄糖调节蛋白78/BiP 和CAAT区增强子结合蛋白同源蛋白以及细胞凋亡蛋白酶-12的活性[60]。白藜芦醇能促进视网膜中Sirt1的表达从而阻止p65乙酰化，抑制视网膜的细胞凋亡[61]。siRNA PF-04523655可以通过RNA干扰抑制低氧诱导基因的表达，可用于DR治疗[62]。此外一些经过锁定核酸修饰的抗miRNA如抗miR-192具有高度特异性和有效性，除miR-192表达水平外，其下游miRNA如miR-216a、miR-217、miR-200家族以及p53水平也被下调，提示抗miRNA将成为DR治疗中的重要途径。且有学者提出，miRNA扩增与遗传变异的知识相结合，将对DR个体化用药的实现提供帮助[16]。
表观遗传修饰位点作为抗DR药物具有很好的前景。但也有研究认为，在终末分化细胞如神经细胞、RPE细胞等，表观遗传改变不易逆转[63]。
3 展望
表观遗传修饰对DR发病的可能机制研究及治疗提供了新的方向，但进一步探讨仍是巨大挑战。除DR外，表观遗传修饰在糖尿病其他血管并发症，如心血管、肾脏疾病等的进展中也起到很大作用，且这些方向的研究也已取得了一定进展[13, 64-66]，对DR的机制研究具有一定借鉴参考意义。DNA甲基化，组蛋白转录后修饰，ncRNA之间的相互作用也是表观遗传调控基因表达的一种方式[67]，有很大的研究空间。曾有文献报道，锻炼可以对糖尿病表观遗传的改变产生有利影响[68]，进一步探讨生活方式的改变是否能改变DR相关表观遗传改变非常有意义。通过大样本对照研究分析表观遗传改变在DR不同时期及病变程度时起的作用对DR的发病机制及治疗也有很大帮助。另外，新技术如下一代基因测序技术[10]的发展及人类全基因组测序计划的实施等对表观遗传机制的进一步研究提供较大帮助。但如何对这些大量的生物学数据进行分析，建立计算机模型是一个不小的难题。若能充分利用大数据的信息，将有助于对糖尿病及其并发症发病机制、病理变化有更深入的了解并有利于新的靶向药物开发，同时对个体化用药也具有指导作用[16]。