引用本文： 汪洋, 颜华. 烟酸对糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响及其机制研究. 中华眼底病杂志, 2016, 32(2): 154-158. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.010 复制
血视网膜屏障(BRB)损伤导致的视网膜血管通透性增加是非增生型糖尿病视网膜病变(DR)的病理特征以及视力丧失的主要原因[1]。DR发生发展过程中，各种炎症因子相互作用可影响BRB的完整性[2]。作为一种调脂药物，烟酸可降低总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)；并且通过烟酸受体G蛋白偶联受体109A(GPR109A)在脂肪组织中抑制甘油三脂水解，从而具有改善血管内皮功能，降低血管通透性的作用[3]。研究发现，GPR109A存在于视网膜上并且在DR发生发展过程中发挥重要作用[4]。但烟酸能否通过视网膜中的GPR109A而影响DR的BRB却少有报道。为此，我们观察探讨了烟酸对糖尿病大鼠BRB的影响及其机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
6～8 周龄、体重210～250 g的无特定病原级雄性Wistar大鼠(北京维通利华实验动物有限公司提供)60只用于本研究。实验动物喂养、使用以及相关操作严格遵循动物实验伦理规范以及天津医科大学实验动物管理伦理委员会的相关规定。以标准颗粒饲养于标准化动物房，自由饮水摄食，室温22~24℃，相对湿度40%~60%。适应性饲养1周后用于实验。
随机数字表法将大鼠分为空白对照组(CON组)、糖尿病模型对照组(DM组)和烟酸处理组(NA组)，每组20只。CON组大鼠仅注射柠檬酸盐缓冲液。DM组、NA组大鼠建立糖尿病模型[5]。建模成功后第7天，NA组大鼠以40 mg/kg的剂量灌胃给予烟酸，1次/d，持续灌胃3个月。CON组、DM组大鼠正常喂食水。
于NA组大鼠灌胃3个月后，3组大鼠均于内眦处取血，采用自动生化分析仪检测血清TC、HDL水平。
于NA组大鼠灌胃3个月后，各组取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉处死，摘取眼球制备石蜡切片。连续4 μm切片，进行常规苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。
于NA组大鼠灌胃3个月后，各组取3只大鼠，以45 mg/kg的剂量尾静脉注射2% 伊凡思蓝(EB)溶液，循环2 h。处死大鼠，摘取眼球，置于浓度为4%多聚甲醛溶液中固定2 h。手术显微镜下除去角膜、虹膜，娩出晶状体和玻璃体，完整分离出视网膜，平铺于载玻片上，封片，立即置于激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察、照相。各组取6只大鼠，EB染色渗漏分析法[6]检测大鼠视网膜血管渗漏性，分别测定其在波长为620、740 nm的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。共测3次，取其平均值。
于NA组大鼠灌胃3个月后，各组取3只大鼠，检测大鼠视网膜中闭合蛋白(Occludin)、封闭蛋白(Claudin)-5、紧密连接蛋白(ZO)-1、GPR109A的mRNA相对表达量。采用Trizol法提取视网膜总RNA，ND-1000微量紫外可见分光光度计检测RNA浓度。根据引物设计原则，由上海生工设计并合成针对大鼠的β-肌动蛋白(actin)、Occludin、Claudin-5、ZO-1、 GPR109A的特异性引物。配置聚合酶链反应(PCR)体系，将反应板放入7700型荧光定量逆转录PCR(RT-PCR)仪进行扩增[7]。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠视 网膜中GPR109A、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)蛋白相对表达量。取-80℃冻存视网膜组织，于细胞裂解液中研磨，取上清液行视网膜总蛋白定量后，行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入GPR109A(1:500)、IL-6(1:1000)、 TNF-α(1:1000)、β-actin(1:1000)抗体孵育过夜，辣根过氧化酶标记的二抗(1:5000)37℃ 孵育1 h。 应用 Bio-Rad 公司的Quantity One 4.4.0 分析软件测定每一个目的条带及其对应的内参β-actin灰度值。按照相对灰度值＝目的条带灰度值/同一样品β-actin 的灰度值计算每个样品相应指标的灰度值，以此代表目的蛋白的表达水平。
采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，计量指标数据资料经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布，以均数±标准差(
2 结果
3组大鼠血清TC、HDL含量比较，差异均有统计学意义(F=22.273、13.306，P＜0.05)。与CON组比较，DM组大鼠血清TC含量明显升高，HDL含量明显降低，差异均有统计学意义(t=4.034、5.831，P＜0.05)。与DM组比较，NA组大鼠血清TC含量明显降低，HDL含量明显升高，差异均有统计学意义(t=6.868、3.369，P＜0.05)(图 1)。
图1
3组大鼠血清TC和HDL含量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
光学显微镜观察发现，CON组大鼠视网膜各层结构清晰，细胞排列整齐、形态正常(图 2A)；DM组大鼠视网膜各层结构变薄，细胞排列紊乱，细胞核肿胀，部分血管明显扩张(图 2B)；NA组大鼠视网膜结构整齐，细胞排列渐规则(图 2C)。
图2
大鼠视网膜光学显微镜像。 2A.CON组，视网膜结构完整，细胞排列整齐；2B.DM组，视网膜各层结构变薄，细胞排列紊乱；2C. NA组，视网膜结构清晰，细胞排列整齐，水肿减轻 HE ×200
荧光显微镜观察发现，CON组大鼠视网膜血管结 构清晰，视网膜血管走形正常，未见荧光渗漏(图 3A)；明显减轻，血管纡曲扩张均不明显(图 3C)。DM组EB平均渗漏量较CON组明显增高，差异有统计学意义(t=24.712，P＜0.05)。NA组EB平均渗漏量较DM组明显减少，差异有统计学意义(t=16.414,P＜0.05)(图 4)。
图3
大鼠视网膜铺片荧光 显微镜像。3A. CON组，视网膜血管走形正常，未见EB渗漏 3B. DM组，可见EB自视网膜血管向外渗出(白箭)；3C. NA组，可见EB自视网膜血管向外渗出(白箭) ×200
图4
3组EB平均渗漏量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
RT-PCR检测结果显示，DM组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相对表达量较CON组明显降低，差异有统计学意义(t=11.422、12.638、12.060，P＜0.05)。NA组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相对表达量较DM组明显增高，差异有统计学意义(t=5.278、3.952、8.030，P＜0.05)。NA组大鼠视网膜GPR109A mRNA相对表达量较DM组明显增高，差异有统计学意义(t=5.053,P＜0.05)(图 5)。
图5
各组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1、GPR109A mRNA相对表达量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
Western blot检测结果显示，DM组大鼠视网膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相对表达量较CON组明显增高，差异有统计学意义(t=4.915、11.106、6.582，P＜0.05)。NA组大鼠视网膜GPR109A蛋白相对表达量较DM组明显增高，差异有统计学意义(t=5.806,P＜0.05)；IL-6、TNF-α蛋白相对表达量较DM组明显降低，差异有统计学意义(t=10.131、5.017，P＜0.05)(图 6)。
图6
3组大鼠视网膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相对表达量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
3 讨论
BRB在维持视网膜微血管完整性中起重要作用，它的破坏会引起DR的一系列改变，最终影响视力。而在DR中，视网膜组织相关蛋白的mRNA和蛋白水平表达下调是BRB功能障碍的主要机制。本研究结果显示，与DM组比较，NA组大鼠视网膜结构整齐，细胞排列渐规则；视网膜血管渗漏明显减轻，血管纡曲扩张均不明显；视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相对表达量明显增高。说明烟酸可以有效改善大鼠视网膜组织结构及血管渗漏情况，同时增加Occludin、Claudin-5、ZO-1的表达。提示烟酸可以修复血管内皮，从而维持BRB功能的完整。
鼠和人体内存在一定的烟酸受体GPR109A，该受体介导了烟酸在脂肪组织抑制甘油三酯水解作用[8]。同时，GPR109A 高度表达在视网膜组织中，尤其是在视网膜色素上皮层，并且起到一定的病理生理作用[4]。有研究表明，GPR109A受体在DR中表达升高，并可对抗DR引起的炎症反应[9]。由此我们推测烟酸或许可以通过激活烟酸受体GPR109A的表达来改善DR。IL-6属于炎症前细胞因子，在DR中显著升高并在其病理过程中起重要作用，可致血管内皮细胞损伤及功能变化[10]。还可诱导血管内皮生长因子的升高，从而促进新生血管的形成以及血管渗透性的改变[11]。TNF-α是一种主要由巨噬细胞和活化单核细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，具有极强的生物学效应。有学者认为，TNF-α参与机体的多种反应，在DR患者视网膜中显著升高并通过增加白细胞浸润介导了一系列炎症反应[12, 13]。与此同时，TNF-α能显著降低ZO-1的表达，共同破坏BRB以导致血管通透性的增加[14]。本研究结果显示，DM组大鼠视网膜GPR109A mRNA表达量较CON组明显增高，而NA组大鼠视网膜GPR109A mRNA表达量较DM进一步增高。DM组大鼠视网膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相对表达量较CON组明显增高；而NA组大鼠视网膜GPR109A蛋白相对表达量较DM进一步增高，但IL-6、TNF-α蛋白相对表达量却较DM组明显降低。说明经烟酸干预后GPR109A被大量激活，而被激活的GPR109A可以显著抑制IL-6和TNF-α的表达，从而起到抑制由DR引起的炎症反应，改善BRB的破坏程度以及血管通透性，以达到延缓DR发展的作用。但是具体相应的调节机制还需进一步研究。
血视网膜屏障(BRB)损伤导致的视网膜血管通透性增加是非增生型糖尿病视网膜病变(DR)的病理特征以及视力丧失的主要原因[1]。DR发生发展过程中，各种炎症因子相互作用可影响BRB的完整性[2]。作为一种调脂药物，烟酸可降低总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)；并且通过烟酸受体G蛋白偶联受体109A(GPR109A)在脂肪组织中抑制甘油三脂水解，从而具有改善血管内皮功能，降低血管通透性的作用[3]。研究发现，GPR109A存在于视网膜上并且在DR发生发展过程中发挥重要作用[4]。但烟酸能否通过视网膜中的GPR109A而影响DR的BRB却少有报道。为此，我们观察探讨了烟酸对糖尿病大鼠BRB的影响及其机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
6～8 周龄、体重210～250 g的无特定病原级雄性Wistar大鼠(北京维通利华实验动物有限公司提供)60只用于本研究。实验动物喂养、使用以及相关操作严格遵循动物实验伦理规范以及天津医科大学实验动物管理伦理委员会的相关规定。以标准颗粒饲养于标准化动物房，自由饮水摄食，室温22~24℃，相对湿度40%~60%。适应性饲养1周后用于实验。
随机数字表法将大鼠分为空白对照组(CON组)、糖尿病模型对照组(DM组)和烟酸处理组(NA组)，每组20只。CON组大鼠仅注射柠檬酸盐缓冲液。DM组、NA组大鼠建立糖尿病模型[5]。建模成功后第7天，NA组大鼠以40 mg/kg的剂量灌胃给予烟酸，1次/d，持续灌胃3个月。CON组、DM组大鼠正常喂食水。
于NA组大鼠灌胃3个月后，3组大鼠均于内眦处取血，采用自动生化分析仪检测血清TC、HDL水平。
于NA组大鼠灌胃3个月后，各组取4只大鼠，10%水合氯醛麻醉处死，摘取眼球制备石蜡切片。连续4 μm切片，进行常规苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。
于NA组大鼠灌胃3个月后，各组取3只大鼠，以45 mg/kg的剂量尾静脉注射2% 伊凡思蓝(EB)溶液，循环2 h。处死大鼠，摘取眼球，置于浓度为4%多聚甲醛溶液中固定2 h。手术显微镜下除去角膜、虹膜，娩出晶状体和玻璃体，完整分离出视网膜，平铺于载玻片上，封片，立即置于激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察、照相。各组取6只大鼠，EB染色渗漏分析法[6]检测大鼠视网膜血管渗漏性，分别测定其在波长为620、740 nm的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。共测3次，取其平均值。
于NA组大鼠灌胃3个月后，各组取3只大鼠，检测大鼠视网膜中闭合蛋白(Occludin)、封闭蛋白(Claudin)-5、紧密连接蛋白(ZO)-1、GPR109A的mRNA相对表达量。采用Trizol法提取视网膜总RNA，ND-1000微量紫外可见分光光度计检测RNA浓度。根据引物设计原则，由上海生工设计并合成针对大鼠的β-肌动蛋白(actin)、Occludin、Claudin-5、ZO-1、 GPR109A的特异性引物。配置聚合酶链反应(PCR)体系，将反应板放入7700型荧光定量逆转录PCR(RT-PCR)仪进行扩增[7]。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠视 网膜中GPR109A、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)蛋白相对表达量。取-80℃冻存视网膜组织，于细胞裂解液中研磨，取上清液行视网膜总蛋白定量后，行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入GPR109A(1:500)、IL-6(1:1000)、 TNF-α(1:1000)、β-actin(1:1000)抗体孵育过夜，辣根过氧化酶标记的二抗(1:5000)37℃ 孵育1 h。 应用 Bio-Rad 公司的Quantity One 4.4.0 分析软件测定每一个目的条带及其对应的内参β-actin灰度值。按照相对灰度值＝目的条带灰度值/同一样品β-actin 的灰度值计算每个样品相应指标的灰度值，以此代表目的蛋白的表达水平。
采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，计量指标数据资料经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布，以均数±标准差(
2 结果
3组大鼠血清TC、HDL含量比较，差异均有统计学意义(F=22.273、13.306，P＜0.05)。与CON组比较，DM组大鼠血清TC含量明显升高，HDL含量明显降低，差异均有统计学意义(t=4.034、5.831，P＜0.05)。与DM组比较，NA组大鼠血清TC含量明显降低，HDL含量明显升高，差异均有统计学意义(t=6.868、3.369，P＜0.05)(图 1)。
图1
3组大鼠血清TC和HDL含量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
光学显微镜观察发现，CON组大鼠视网膜各层结构清晰，细胞排列整齐、形态正常(图 2A)；DM组大鼠视网膜各层结构变薄，细胞排列紊乱，细胞核肿胀，部分血管明显扩张(图 2B)；NA组大鼠视网膜结构整齐，细胞排列渐规则(图 2C)。
图2
大鼠视网膜光学显微镜像。 2A.CON组，视网膜结构完整，细胞排列整齐；2B.DM组，视网膜各层结构变薄，细胞排列紊乱；2C. NA组，视网膜结构清晰，细胞排列整齐，水肿减轻 HE ×200
荧光显微镜观察发现，CON组大鼠视网膜血管结 构清晰，视网膜血管走形正常，未见荧光渗漏(图 3A)；明显减轻，血管纡曲扩张均不明显(图 3C)。DM组EB平均渗漏量较CON组明显增高，差异有统计学意义(t=24.712，P＜0.05)。NA组EB平均渗漏量较DM组明显减少，差异有统计学意义(t=16.414,P＜0.05)(图 4)。
图3
大鼠视网膜铺片荧光 显微镜像。3A. CON组，视网膜血管走形正常，未见EB渗漏 3B. DM组，可见EB自视网膜血管向外渗出(白箭)；3C. NA组，可见EB自视网膜血管向外渗出(白箭) ×200
图4
3组EB平均渗漏量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
RT-PCR检测结果显示，DM组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相对表达量较CON组明显降低，差异有统计学意义(t=11.422、12.638、12.060，P＜0.05)。NA组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相对表达量较DM组明显增高，差异有统计学意义(t=5.278、3.952、8.030，P＜0.05)。NA组大鼠视网膜GPR109A mRNA相对表达量较DM组明显增高，差异有统计学意义(t=5.053,P＜0.05)(图 5)。
图5
各组大鼠视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1、GPR109A mRNA相对表达量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
Western blot检测结果显示，DM组大鼠视网膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相对表达量较CON组明显增高，差异有统计学意义(t=4.915、11.106、6.582，P＜0.05)。NA组大鼠视网膜GPR109A蛋白相对表达量较DM组明显增高，差异有统计学意义(t=5.806,P＜0.05)；IL-6、TNF-α蛋白相对表达量较DM组明显降低，差异有统计学意义(t=10.131、5.017，P＜0.05)(图 6)。
图6
3组大鼠视网膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相对表达量比较。*与CON组比较，P＜0.05；#与DM组比较，P＜0.05
3 讨论
BRB在维持视网膜微血管完整性中起重要作用，它的破坏会引起DR的一系列改变，最终影响视力。而在DR中，视网膜组织相关蛋白的mRNA和蛋白水平表达下调是BRB功能障碍的主要机制。本研究结果显示，与DM组比较，NA组大鼠视网膜结构整齐，细胞排列渐规则；视网膜血管渗漏明显减轻，血管纡曲扩张均不明显；视网膜Occludin、Claudin-5、ZO-1 mRNA相对表达量明显增高。说明烟酸可以有效改善大鼠视网膜组织结构及血管渗漏情况，同时增加Occludin、Claudin-5、ZO-1的表达。提示烟酸可以修复血管内皮，从而维持BRB功能的完整。
鼠和人体内存在一定的烟酸受体GPR109A，该受体介导了烟酸在脂肪组织抑制甘油三酯水解作用[8]。同时，GPR109A 高度表达在视网膜组织中，尤其是在视网膜色素上皮层，并且起到一定的病理生理作用[4]。有研究表明，GPR109A受体在DR中表达升高，并可对抗DR引起的炎症反应[9]。由此我们推测烟酸或许可以通过激活烟酸受体GPR109A的表达来改善DR。IL-6属于炎症前细胞因子，在DR中显著升高并在其病理过程中起重要作用，可致血管内皮细胞损伤及功能变化[10]。还可诱导血管内皮生长因子的升高，从而促进新生血管的形成以及血管渗透性的改变[11]。TNF-α是一种主要由巨噬细胞和活化单核细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，具有极强的生物学效应。有学者认为，TNF-α参与机体的多种反应，在DR患者视网膜中显著升高并通过增加白细胞浸润介导了一系列炎症反应[12, 13]。与此同时，TNF-α能显著降低ZO-1的表达，共同破坏BRB以导致血管通透性的增加[14]。本研究结果显示，DM组大鼠视网膜GPR109A mRNA表达量较CON组明显增高，而NA组大鼠视网膜GPR109A mRNA表达量较DM进一步增高。DM组大鼠视网膜GPR109A、IL-6、TNF-α蛋白相对表达量较CON组明显增高；而NA组大鼠视网膜GPR109A蛋白相对表达量较DM进一步增高，但IL-6、TNF-α蛋白相对表达量却较DM组明显降低。说明经烟酸干预后GPR109A被大量激活，而被激活的GPR109A可以显著抑制IL-6和TNF-α的表达，从而起到抑制由DR引起的炎症反应，改善BRB的破坏程度以及血管通透性，以达到延缓DR发展的作用。但是具体相应的调节机制还需进一步研究。
