严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）不仅影响人体呼吸系统，还可对其他多系统造成损害[1]。其中，SARS-CoV-2感染者多部位血栓形成即是血管系统损伤的显著特征，其原因与血液高凝状态、血小板激活及内皮功能障碍密切相关[2-3]。视网膜血管阻塞为视网膜血管性疾病，是SARS-CoV-2感染患者中观察到的血管异常并发症之一[4-5]。Invernizzi等[6]发现SARS-CoV-2感染患者具有与视网膜中央静脉阻塞（CRVO）类似的凝血异常和炎症模式。但对这些报告的结果需谨慎解读。Rego等[7]报道的病例中，发生视网膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者出现玻璃体积血且伴有高糖化血红蛋白水平（13%），提示发生视网膜血管阻塞的首要因素可能是糖尿病视网膜病变而非SARS-CoV-2感染。此外，Walinjkar等[8]观察发现，发生视网膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者具有多囊卵巢综合症及砷暴露病史，而这二者均为静脉血栓的独立风险因素[9-10]。因此，发生视网膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者中缺乏直接因SARS-CoV-2感染而引发的凝血或炎症标志，并存在高血压等混淆变量，其与视网膜血管阻塞间的确切因果路径尚未明确[11-13]。孟德尔随机化（MR）是一种统计模型，其利用与暴露因素具有强相关的遗传变异作为工具变量（IV），能规避观察性研究带来的潜在混杂、反向因果等偏倚风险，在某种程度上与随机对照研究相似，可用于评估暴露因素与结局因素之间的因果关系[14-15]。本研究采用MR分析方法，系统探索SARS-CoV-2不同感染表型与视网膜血管阻塞之间有无因果关联。现将结果报道如下。
1 对象和方法
1.1 研究设计
MR分析中必须满足以下3个关键假设：（1）有效IV与暴露密切相关；（2）IV与可能影响暴露和结果的任何混杂因素无关；（3）IV仅通过暴露影响结果[16]（图1）。本研究涉及以下关键步骤：选择与暴露相关的遗传IV，利用各种MR方法对结果的敏感性（包括异质性以及基因的多效性）进行综合分析。研究遵循《使用孟德尔随机化加强流行病学观察性研究的报告：STROBE-MR声明》[17]。
图1
孟德尔随机化研究设计框架 假设1：工具变量与暴露因素相关；假设 2：工具变量不与任何混杂因素相关；假设 3：工具变量不能通过除暴露外的因素与视网膜血管阻塞相关
1.2 数据来源
SARS-CoV-2感染及视网膜动脉阻塞（RAO）和视网膜静脉阻塞（RVO），包括CRVO、视网膜分支静脉阻塞（BRVO）等视网膜血管阻塞数据均采用欧洲人群全基因组关联研究（GWAS）的汇总统计数据。
SARS-CoV-2感染的GWAS数据源于新型冠状病毒感染（COVID-19）宿主遗传学计划公布的第七版数据库（https://www.covid19hg.org/results/r7/），包含SARS-CoV-2普通感染者、感染住院者、重症感染者，分别为2 597 856、2 095 324、1 086 211例。
RAO、RVO数据来自FinnGen数据库（
1.3 统计方法
IV选择。使用R软件从GWAS数据中选择与SARS-CoV-2感染和视网膜血管阻塞相关的单核苷酸多态性（SNP）作为IV。选择标准：（1）P＜5×10-8，若此条件下IV数量＜5，则条件放宽为P＜5×10-5；（2）连锁不平衡参数（R2）＜0.001，且遗传距离＜10 000 kb；（3）采用F统计量筛除弱效工具变量（F＜10），以防偏倚[19]。排除离群值SNP（rs10850097、 rs550057）及存在连锁不平衡的SNP，最终纳入13个与普通SARS-CoV-2感染相关SNP、33个与SARS-CoV-2感染住院相关的SNP、26个与重症SARS-CoV-2感染相关的SNP作为MR分析的IV。分析方式采用比值比（OR）及95%可信区间（CI）。
MR分析策略。采用逆方差加权（IVW）、随机效应模型作为主要分析方法[20]。该方法假设所有遗传变异的因果效应估计相等且没有水平异质性。通过回归分析估计每个变异体与表型之间的相关效应和标准误差。同时使用MR-Egger、加权中位数（WM）、简单模式和加权模式作为补充方法检测主分析的稳健性[21-23]。只有当IVW显示统计学意义，且MR Egger、WM、简单模式和加权模式的效应值方向与IVW一致时，该MR研究才能得出暴露对结局具有因果影响的结论。
敏感性分析。首先，采用IVW、MR-Egger进行Cochran's Q检验，以评估SNP之间的异质性，P＜0.05表示存在异质性[24]。其次，采用MR多态性残差和离群值（MR-Presso）检测SNP离群值及多效性残差，迭代次数设定为5 000[25]，P＜0.05表示存在异常值，将其删除并重新进行分析。最后，通过MR-Egger截距检验评估水平多效性，若截距项的估计值接近于0，并且对应的P值＞0.05，则认为结果不存在显著的水平多效性。
MR分析通过R软件（版本4.2.1）的“TwoSampleMR”包进行[23]。
2 结果
2.1 SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞的MR分析
IVW、随机效应模型、MR-Egger、WM、加权模式分析结果显示，SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重症感染均与视网膜血管阻塞无显著关联（P＞0.05）；简单模式下SARS-CoV-2重症感染与RVO存在关联（P＜0.05）（表1；图2，3）。
表1
SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞的MR分析结果
图2
不同SARS-CoV-2感染表型与RAO发病风险的森林图 SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；RAO：视网膜动脉阻塞；OR：比值比；CI：可信区间
图3
不同SARS-CoV-2感染表型与RVO发病风险的森林图 SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；RVO：视网膜静脉阻塞；OR：比值比；CI：可信区间
2.2 视网膜血管阻塞与SARS-CoV-2感染的MR分析
IVW、随机效应模型、MR-Egger、WM、加权模式结果显示，RAO、RVO与SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重症感染均无显著关联（P＞0.05）；简单模式下RVO与SARS-CoV-2普通感染存在关联（P＜0.05）（表2；图4，5）。
表2
视网膜血管阻塞与SARS-CoV-2感染的MR分析结果
图4
RAO与不同SARS-CoV-2感染表型的森林图 RAO：视网膜动脉阻塞；SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；OR：比值比；CI：可信区间
图5
RVO与不同SARS-CoV-2感染表型的森林图 RVO：视网膜静脉阻塞；SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；OR：比值比；CI：可信区间
2.3 敏感性分析
异质性检验：IVW、MR-Egger未观察到不同暴露与结局存在异质性（均P＞0.05）。水平多效性分析：MR-Egger无水平多效性证据（均P＞0.05）；MR-Presso：未发现离群的SNP。（表3，4）
表3
SARS-CoV-2 感染对视网膜血管阻塞风险的敏感性分析
表4
视网膜血管阻塞对SARS-CoV-2感染风险的敏感性分析
3 讨论
本研究探讨了SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间的潜在联系。结果显示，SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间不存在直接因果联系。反向MR分析结果也表明，视网膜血管阻塞不会增加或减少SARS-CoV-2感染风险。尽管简单模式下SARS-CoV-2重症感染对RVO的因果影响以及RVO与SARS-CoV-2普通感染之间的关联显示有统计学意义，但对此结果需谨慎解读。考虑到其他分析方法并未一致支持这一关联，因此尚不能仅凭简单模式结果就认为SARS-CoV-2重症感染对RVO有因果影响以及RVO患者更容易被SARS-CoV-2感染的结论。因此，进一步的研究和验证是必要的，以确保结论的准确性和可靠性。
目前关于SARS-CoV-2感染与RAO之间关联性仍然存在争议。有学者认为，两者之间可能具有相关性[26-27]，但由于这类观察性研究未能提供患者是否患有系统性疾病（如高血压）的资料，因此对其结果的解释面临挑战。值得关注的是，一项多中心、回顾性、非连续性病例研究针对2020年3月至2021年3月确诊的RAO或CRVO并发SARS-CoV-2感染患者进行了分析，研究者排除了年龄＞50岁以及合并有高血压、糖尿病、青光眼、肥胖、血液高凝状态和SARS-CoV-2重症感染等病史者。然而，受限于样本量较小和非连续性研究设计等因素，此项研究同样未能证实SARS-CoV-2感染是导致视网膜血管阻塞的独立风险因素[28]。
近期的观察性及回顾性研究致力于探索SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间的可能联系。然而，这些研究受限于未能充分校正糖尿病、高血压等潜在混杂因素，并缺少研究对象的凝血与炎症指标数据，因而难以直接证实因果关系。MR分析通过有效控制未知混杂变量，为解决此类观察性研究所固有的因果推断问题提供了有力工具，尤其适用于SARS-CoV-2感染这类自然暴露情况。MR分析通过评估终身暴露效应，补充了随机临床试验的不足。
本研究还回顾了两项队列研究结果[29-30]。第一项回顾性队列研究旨在分析COVID-19大流行期间RAO或RVO的新发病例是否有所增加。研究发现，在COVID-19大流行的早期阶段，RAO和RVO的新发病例占所有新发视网膜疾病的比例有所上升，特别是CRAO、CRVO、BRAO。但随时间推移，这些疾病的新发病例比例又恢复至与大流行前相似的水平[29]。然而，该研究存在一些偏倚，如缺乏详尽临床数据和基线对照，且研究在私人视网膜诊所开展，可能由于COVID-19大流行期间的社会管控措施，部分视网膜血管阻塞患者倾向于选择私人诊所就诊，导致该诊所在大流行初期视网膜血管阻塞患者比例上升。第二项在美国进行的队列研究则发现，在COVID-19诊断后6个月内，与诊断前比较，RVO的发生风险有所增加，但这种增加可能与大流行期间的其他因素相关，如因COVID-19大流行期间降压药物购买不便而出现血压控制不佳或户外活动减少而引起的血栓状态。该研究纳入432 515例诊断为COVID-19的患者，平均年龄40.9岁，其中女性患者占53.6%。结果显示，在COVID-19诊断后6个月内，发生RAO、RVO分别为16、65例。由于该研究为观察性队列研究，缺乏随机对照，因此无法确立因果关系。需进一步大规模流行病学研究来深入探索视网膜血管阻塞与SARS-CoV-2感染之间的关联[30]。
尽管本研究主要分析了欧洲血统人群，并未考虑非线性关联及部分未知混杂因素，但基于大规模GWAS数据的双向MR分析结果强烈提示，SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间不存在因果效应。总体而言，本研究加强了SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间无直接因果关系的论断。未来的研究应进一步验证这一结论，并利用MR分析探索其他可能的交互影响因素。
作者贡献声明 魏熙翔：研究设计、采集数据、分析/解释数据、撰写/修改文章；杨晖：研究设计、分析/解释数据、修改文章；尹雪、傅征、熊薇薇：研究设计、修改文章
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）不仅影响人体呼吸系统，还可对其他多系统造成损害[1]。其中，SARS-CoV-2感染者多部位血栓形成即是血管系统损伤的显著特征，其原因与血液高凝状态、血小板激活及内皮功能障碍密切相关[2-3]。视网膜血管阻塞为视网膜血管性疾病，是SARS-CoV-2感染患者中观察到的血管异常并发症之一[4-5]。Invernizzi等[6]发现SARS-CoV-2感染患者具有与视网膜中央静脉阻塞（CRVO）类似的凝血异常和炎症模式。但对这些报告的结果需谨慎解读。Rego等[7]报道的病例中，发生视网膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者出现玻璃体积血且伴有高糖化血红蛋白水平（13%），提示发生视网膜血管阻塞的首要因素可能是糖尿病视网膜病变而非SARS-CoV-2感染。此外，Walinjkar等[8]观察发现，发生视网膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者具有多囊卵巢综合症及砷暴露病史，而这二者均为静脉血栓的独立风险因素[9-10]。因此，发生视网膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者中缺乏直接因SARS-CoV-2感染而引发的凝血或炎症标志，并存在高血压等混淆变量，其与视网膜血管阻塞间的确切因果路径尚未明确[11-13]。孟德尔随机化（MR）是一种统计模型，其利用与暴露因素具有强相关的遗传变异作为工具变量（IV），能规避观察性研究带来的潜在混杂、反向因果等偏倚风险，在某种程度上与随机对照研究相似，可用于评估暴露因素与结局因素之间的因果关系[14-15]。本研究采用MR分析方法，系统探索SARS-CoV-2不同感染表型与视网膜血管阻塞之间有无因果关联。现将结果报道如下。
1 对象和方法
1.1 研究设计
MR分析中必须满足以下3个关键假设：（1）有效IV与暴露密切相关；（2）IV与可能影响暴露和结果的任何混杂因素无关；（3）IV仅通过暴露影响结果[16]（图1）。本研究涉及以下关键步骤：选择与暴露相关的遗传IV，利用各种MR方法对结果的敏感性（包括异质性以及基因的多效性）进行综合分析。研究遵循《使用孟德尔随机化加强流行病学观察性研究的报告：STROBE-MR声明》[17]。
图1
孟德尔随机化研究设计框架 假设1：工具变量与暴露因素相关；假设 2：工具变量不与任何混杂因素相关；假设 3：工具变量不能通过除暴露外的因素与视网膜血管阻塞相关
1.2 数据来源
SARS-CoV-2感染及视网膜动脉阻塞（RAO）和视网膜静脉阻塞（RVO），包括CRVO、视网膜分支静脉阻塞（BRVO）等视网膜血管阻塞数据均采用欧洲人群全基因组关联研究（GWAS）的汇总统计数据。
SARS-CoV-2感染的GWAS数据源于新型冠状病毒感染（COVID-19）宿主遗传学计划公布的第七版数据库（https://www.covid19hg.org/results/r7/），包含SARS-CoV-2普通感染者、感染住院者、重症感染者，分别为2 597 856、2 095 324、1 086 211例。
RAO、RVO数据来自FinnGen数据库（
1.3 统计方法
IV选择。使用R软件从GWAS数据中选择与SARS-CoV-2感染和视网膜血管阻塞相关的单核苷酸多态性（SNP）作为IV。选择标准：（1）P＜5×10-8，若此条件下IV数量＜5，则条件放宽为P＜5×10-5；（2）连锁不平衡参数（R2）＜0.001，且遗传距离＜10 000 kb；（3）采用F统计量筛除弱效工具变量（F＜10），以防偏倚[19]。排除离群值SNP（rs10850097、 rs550057）及存在连锁不平衡的SNP，最终纳入13个与普通SARS-CoV-2感染相关SNP、33个与SARS-CoV-2感染住院相关的SNP、26个与重症SARS-CoV-2感染相关的SNP作为MR分析的IV。分析方式采用比值比（OR）及95%可信区间（CI）。
MR分析策略。采用逆方差加权（IVW）、随机效应模型作为主要分析方法[20]。该方法假设所有遗传变异的因果效应估计相等且没有水平异质性。通过回归分析估计每个变异体与表型之间的相关效应和标准误差。同时使用MR-Egger、加权中位数（WM）、简单模式和加权模式作为补充方法检测主分析的稳健性[21-23]。只有当IVW显示统计学意义，且MR Egger、WM、简单模式和加权模式的效应值方向与IVW一致时，该MR研究才能得出暴露对结局具有因果影响的结论。
敏感性分析。首先，采用IVW、MR-Egger进行Cochran's Q检验，以评估SNP之间的异质性，P＜0.05表示存在异质性[24]。其次，采用MR多态性残差和离群值（MR-Presso）检测SNP离群值及多效性残差，迭代次数设定为5 000[25]，P＜0.05表示存在异常值，将其删除并重新进行分析。最后，通过MR-Egger截距检验评估水平多效性，若截距项的估计值接近于0，并且对应的P值＞0.05，则认为结果不存在显著的水平多效性。
MR分析通过R软件（版本4.2.1）的“TwoSampleMR”包进行[23]。
2 结果
2.1 SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞的MR分析
IVW、随机效应模型、MR-Egger、WM、加权模式分析结果显示，SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重症感染均与视网膜血管阻塞无显著关联（P＞0.05）；简单模式下SARS-CoV-2重症感染与RVO存在关联（P＜0.05）（表1；图2，3）。
表1
SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞的MR分析结果
图2
不同SARS-CoV-2感染表型与RAO发病风险的森林图 SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；RAO：视网膜动脉阻塞；OR：比值比；CI：可信区间
图3
不同SARS-CoV-2感染表型与RVO发病风险的森林图 SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；RVO：视网膜静脉阻塞；OR：比值比；CI：可信区间
2.2 视网膜血管阻塞与SARS-CoV-2感染的MR分析
IVW、随机效应模型、MR-Egger、WM、加权模式结果显示，RAO、RVO与SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重症感染均无显著关联（P＞0.05）；简单模式下RVO与SARS-CoV-2普通感染存在关联（P＜0.05）（表2；图4，5）。
表2
视网膜血管阻塞与SARS-CoV-2感染的MR分析结果
图4
RAO与不同SARS-CoV-2感染表型的森林图 RAO：视网膜动脉阻塞；SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；OR：比值比；CI：可信区间
图5
RVO与不同SARS-CoV-2感染表型的森林图 RVO：视网膜静脉阻塞；SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型；OR：比值比；CI：可信区间
2.3 敏感性分析
异质性检验：IVW、MR-Egger未观察到不同暴露与结局存在异质性（均P＞0.05）。水平多效性分析：MR-Egger无水平多效性证据（均P＞0.05）；MR-Presso：未发现离群的SNP。（表3，4）
表3
SARS-CoV-2 感染对视网膜血管阻塞风险的敏感性分析
表4
视网膜血管阻塞对SARS-CoV-2感染风险的敏感性分析
3 讨论
本研究探讨了SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间的潜在联系。结果显示，SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间不存在直接因果联系。反向MR分析结果也表明，视网膜血管阻塞不会增加或减少SARS-CoV-2感染风险。尽管简单模式下SARS-CoV-2重症感染对RVO的因果影响以及RVO与SARS-CoV-2普通感染之间的关联显示有统计学意义，但对此结果需谨慎解读。考虑到其他分析方法并未一致支持这一关联，因此尚不能仅凭简单模式结果就认为SARS-CoV-2重症感染对RVO有因果影响以及RVO患者更容易被SARS-CoV-2感染的结论。因此，进一步的研究和验证是必要的，以确保结论的准确性和可靠性。
目前关于SARS-CoV-2感染与RAO之间关联性仍然存在争议。有学者认为，两者之间可能具有相关性[26-27]，但由于这类观察性研究未能提供患者是否患有系统性疾病（如高血压）的资料，因此对其结果的解释面临挑战。值得关注的是，一项多中心、回顾性、非连续性病例研究针对2020年3月至2021年3月确诊的RAO或CRVO并发SARS-CoV-2感染患者进行了分析，研究者排除了年龄＞50岁以及合并有高血压、糖尿病、青光眼、肥胖、血液高凝状态和SARS-CoV-2重症感染等病史者。然而，受限于样本量较小和非连续性研究设计等因素，此项研究同样未能证实SARS-CoV-2感染是导致视网膜血管阻塞的独立风险因素[28]。
近期的观察性及回顾性研究致力于探索SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间的可能联系。然而，这些研究受限于未能充分校正糖尿病、高血压等潜在混杂因素，并缺少研究对象的凝血与炎症指标数据，因而难以直接证实因果关系。MR分析通过有效控制未知混杂变量，为解决此类观察性研究所固有的因果推断问题提供了有力工具，尤其适用于SARS-CoV-2感染这类自然暴露情况。MR分析通过评估终身暴露效应，补充了随机临床试验的不足。
本研究还回顾了两项队列研究结果[29-30]。第一项回顾性队列研究旨在分析COVID-19大流行期间RAO或RVO的新发病例是否有所增加。研究发现，在COVID-19大流行的早期阶段，RAO和RVO的新发病例占所有新发视网膜疾病的比例有所上升，特别是CRAO、CRVO、BRAO。但随时间推移，这些疾病的新发病例比例又恢复至与大流行前相似的水平[29]。然而，该研究存在一些偏倚，如缺乏详尽临床数据和基线对照，且研究在私人视网膜诊所开展，可能由于COVID-19大流行期间的社会管控措施，部分视网膜血管阻塞患者倾向于选择私人诊所就诊，导致该诊所在大流行初期视网膜血管阻塞患者比例上升。第二项在美国进行的队列研究则发现，在COVID-19诊断后6个月内，与诊断前比较，RVO的发生风险有所增加，但这种增加可能与大流行期间的其他因素相关，如因COVID-19大流行期间降压药物购买不便而出现血压控制不佳或户外活动减少而引起的血栓状态。该研究纳入432 515例诊断为COVID-19的患者，平均年龄40.9岁，其中女性患者占53.6%。结果显示，在COVID-19诊断后6个月内，发生RAO、RVO分别为16、65例。由于该研究为观察性队列研究，缺乏随机对照，因此无法确立因果关系。需进一步大规模流行病学研究来深入探索视网膜血管阻塞与SARS-CoV-2感染之间的关联[30]。
尽管本研究主要分析了欧洲血统人群，并未考虑非线性关联及部分未知混杂因素，但基于大规模GWAS数据的双向MR分析结果强烈提示，SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间不存在因果效应。总体而言，本研究加强了SARS-CoV-2感染与视网膜血管阻塞之间无直接因果关系的论断。未来的研究应进一步验证这一结论，并利用MR分析探索其他可能的交互影响因素。
作者贡献声明 魏熙翔：研究设计、采集数据、分析/解释数据、撰写/修改文章；杨晖：研究设计、分析/解释数据、修改文章；尹雪、傅征、熊薇薇：研究设计、修改文章
