引用本文： 李萍萍, 韩梦瑶, 张睿, 陈芳雨, 李艳子, 袁景, 马宁, 李朝辉, 李璐, 吴建华. 数据非依赖性采集分析孔源性视网膜脱离合并脉络膜脱离患者玻璃体液的蛋白质组学变化. 中华眼底病杂志, 2024, 40(10): 758-765. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20240528-00210 复制
孔源性视网膜脱离（RRD）合并脉络膜脱离是一种特殊类型的RRD，通常伴随眼压降低、严重葡萄膜炎和血视网膜屏障破坏，预后较差[1]。年龄、高度近视、既往眼科手术史、多处视网膜撕裂等是其发生的危险因素[2]。关于RRDCD发病机制，一种假说认为低眼压是其始动因素，脉络膜血管在低眼压状态下失去支撑而扩张，血管屏障系统遭到破坏，使得富含蛋白质的液体渗出到脉络膜和睫状体上腔[3-4]。另一种理论认为，视网膜脱离后引起的眼内炎症刺激大量液体渗出至脉络膜和睫状体上腔促进脉络膜脱离[5]。但RRDCD的具体发病机制及分子学特征，目前仍无明确定论。蛋白质组学本质上是指在大规模水平上研究蛋白质的特征改变，以便在蛋白质层面获得对疾病更为全面的了解。近年发展的数据非依赖性采集（DIA）技术是将整个扫描范围分为多个窗口，依次选择碎裂采集所有母离子全部子离子的信息，生成更全面的二级质谱。与传统质谱技术比较，可以有效测定复杂样品中低丰度蛋白质，从而提高定量分析的可信度[6]。本研究采用DIA质谱技术，分析RRDCD患者玻璃体液蛋白质组学特征改变，初步探讨RRDCD的可能发病机制和病理过程。现将结果报道如下。
1 对象和方法
临床前瞻性横断面研究。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，经武汉大学附属爱尔眼科医院伦理委员会审批（伦理审查号：2023IRBKY120901），并取得患者书面知情同意。
1.1 对象
2021年11月至2023年12月于武汉大学附属爱尔眼科医院检查确诊的RRDCD患者35例（RRDCD组）和RRD患者40例（RRD组）的玻璃体液标本纳入本研究。纳入标准：（1）临床检查确诊的原发性RRD和RRDCD；（2）未经任何治疗；（3）随访时间≥6个月。排除标准：（1）眼外伤等继发性RRD和RRDCD；（2）近期有口服糖皮质激素或眼部用药史；（3）合并糖尿病、高血压性视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性；（4）既往有内眼手术史、葡萄膜炎、全身系统性疾病史者。
患者均行裂隙灯显微镜联合前置镜、最佳矫正视力（BCVA）、光相干断层扫描、超广角眼底成像、B型超声、超声生物显微镜检查以及眼轴长度（AL）测量。BCVA检查采用标准对数视力表进行，统计分析时转换为最小分辨角对数（logMAR）视力。将眼压＜10 mm Hg（1 mm Hg=0.133kPa）定义为低眼压。
1.2 标本制备
患者均行经睫状体平坦部三通道23G玻璃体切割手术（PPV）。手术由同一名资深眼底病外科医生完成。手术开始未开放眼内灌注前，切除并抽吸玻璃体液0.3～0.5 ml，移至1 ml微量离心管中，－80 °C冻存备用。1周内，简单随机抽样法分别选取RRDCD组、RRD组各4例行蛋白质组学分析；酶联免疫吸附试验（ELISA）验证3例。
玻璃体样品中加入裂解液[1%脱氧胆酸钠、100 mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH=8.5；10 mmol/L三（2-羧乙基）膦、40 mmol/L乙酰丙酮钙]，60 ℃孵育30 min进行还原烷基化反应。采用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白补齐至相同体积，加入等体积去离子水，将脱氧胆酸钠浓度稀释至0.5%以下，按照酶与蛋白1:50加入胰蛋白酶，37 ℃孵育振荡过夜进行酶切。次日加入三氟乙酸终止酶切，取上清进行脱盐柱脱盐，真空抽干后－20 ℃冻存。
1.3 质谱分析
采用美国赛默飞世尔科技公司UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱仪和德国布鲁克公司tims TOF Pro质谱仪进行质谱分析。肽段样品经自动进样器吸入后结合至Trap柱（75 μm × 20 mm，填料规格2 μm，100 A），洗脱至分析柱（75 μm × 250 mm，填料规格1.6 μm，100 A）进行分离。利用两个流动相建立分析梯度。液相流速设置为300 nl/min。肽段通过Captive Spray纳升离子源进入质谱进行扫描，开启TIMS功能，采用diaPASEF扫描模式。DIA窗口在tims Control软件中进行定义。每个扫描循环由1个MS1扫描和定义的diaPASEF扫描组成。
1.4 差异表达蛋白筛选及鉴定
筛选标准为RRDCD组与RRD组蛋白定量比值＞1.5，即差异倍数＞1.5和两组样品蛋白定量数据进行t检验计算所得P＜0.05筛选差异蛋白。
使用Uniprot中Human的蛋白质组参考数据库对质谱采集的原始数据进行数据库的搜索。通过DIA-NN中的深度学习算法预测一个谱图库，应用预测的谱图库和MBR功能得到的谱图库对DIA原始数据进行提取，得到蛋白定量信息。最终结果以1%错误发现率对母离子和蛋白水平进行筛选。
1.5 ELISA验证
采用简单随机抽样方法，对鉴定出的差异蛋白进行编号。采用电脑生成的随机数程序，随机选取3个差异表达蛋白行ELISA验证。
1.6 生物信息学分析
采用eggNOG-mapper软件对差异蛋白进行基因注释（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析。GO功能富集分析包括生物进程、细胞组分、分子功能；KEGG通路显著性富集分析包括分子过程、外环境信息传递、人类疾病、新陈代谢、生物系统。分别选择富集程度最高的21、11个条目绘制富集直方图和气泡图。
1.7 统计学分析
采用SPSS26.0软件行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示；组间比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。计数资料以百分率（%）表示；组间比较采用χ2检验。将单因素分析中P＜0.05的因素纳入二元logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者临床特征
RRDCD组、RRD组患者间年龄、性别构成比、发病时间、高度近视率、裂孔累及黄斑、裂孔位置比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；眼压、裂孔数量、视网膜脱离范围、AL、手术后增生性玻璃体视网膜病变（PVR）发生率、一次手术复位率、手术后6个月logMAR BCVA比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1
RRDCD组、RRD组患者基线资料比较
Logistic回归分析结果显示，眼压、AL、视网膜脱离范围、视网膜裂孔数量是RRDCD发生的独立危险因素（表2）。
表2
二元logistic回归分析结果
2.2 差异表达蛋白分析
RRDCD组、RRD组样本相关系数多数位于0.7～1.0，相关性较强，数据可重复性较高（图1A）；样本组成相似性良好（图1B）；蛋白质表达水平具有明显差异（图1C）。
图1
RRDCD组、RRD组定量蛋白质组学分析
1A示两组差异蛋白Pearson相关系数；1B示两组样本中所含蛋白质定量韦恩图，上图、下图分别代表RRD组、RRDCD组蛋白质数量；1C示两组差异蛋白聚类热图，红色越深表示差异表达蛋白表达水平越高，蓝色越深表示差异表达蛋白表达水平越低 RRD：孔源性视网膜脱离；RRDCD：RRD合并脉络膜脱离
RRDCD组、RRD组玻璃体液标本中蛋白质浓度分别为（5.84±1.12）、（2.36±1.96）μg/μl，差异有统计学意义（t=3.083，P=0.01）。两组间共筛选出237个差异表达蛋白，其中上调、下调蛋白分别为63、174个。排名前10的上调蛋白为α-胰蛋白酶抑制剂（ITHI1）、载脂蛋白L1、血清淀粉样蛋白（SAA4）、分泌型磷蛋白、玻连蛋白（VTN）等；下调蛋白为二甲基精氨酸二甲胺水解酶、粘附G蛋白偶联受体、组蛋白酶H等（表3）。
表3
RRDCD组、RRD组间排名前10的差异表达蛋白
2.3 ELISA验证质谱结果的可靠性
ELISA验证结果显示，随机选取的3个差异表达蛋白在RRDCD组和RRD之间的表达变化趋势均与DIA质谱分析结果一致（图2）。
图2
随机选择的3个差异表达蛋白的ELISA验证结果（n=3）
2A～2C分别示ITHI1、SAA4、VTN，**
2.4 生物信息学分析
GO功能富集分析结果显示，237个差异表达蛋白与不同的生物学进程、分子功能和细胞组分有关。生物进程方面，差异表达蛋白显著富集在多细胞生物发育、血浆脂蛋白颗粒组织及清除、解剖结构发育等；分子功能方面，差异表达蛋白显著富集在细胞外环境、基质、蛋白质-脂质复合物、内膜系统等；细胞成分方面，差异表达蛋白显著富集在脂质转运体活性、受体调节剂活性、酶调节剂活性等（图3）。与RRD组比较，RRDCD组差异表达蛋白显著富集于生物及细胞黏附、补体激活、细胞收缩、脂质代谢过程相关蛋白质。这些蛋白质主要分布在细胞膜、细胞基质和细胞外环境中。
图3
GO功能富集分析结果图
3A示直方图，柱线代表富集GO条目的
KEGG信号通路富集分析结果显示，237个差异蛋白富集于11条代谢通路（图4，表4）。其中，20个差异表达蛋白富集于补体和凝血级联通路；16个差异表达蛋白富集于溶酶体通路；13个差异表达蛋白富集于细胞外环境-受体相互作用和人乳头瘤病毒感染通路。
图4
KEGG信号通路富集分析结果图
4A示直方图，柱线代表富集通路KEGG条目的
表4
差异表达蛋白KEGG通路富集结果
3 讨论
目前蛋白质组学研究主要针对PVR、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变，而对于RRDCD研究则相对较少。既往研究发现，相较于视网膜前膜，RRDCD患者玻璃体液中鉴定出249种差异表达蛋白，上调蛋白主要涉及炎症及补体免疫反应[7]。本研究采用精确度更高的DIA质谱技术鉴定RRD、RRDCD患者玻璃体液中蛋白质表达变化，共发现237种差异表达蛋白，其中上调、下调蛋白分别为63、174种。具有差异表达的蛋白质与细胞迁移、补体成分和细胞黏附等生物过程相关；通路富集分析发现，补体与凝血级联、溶酶体通路和细胞外基质（ECM）重塑在RRDCD发挥重要作用。ELISA证实VTN、ITHI1、SAA4水平上调，与DIA蛋白质组学结果一致。
既往研究发现，RRDCD中炎症和免疫反应促进补体成分激活，引起视网膜血管通透性增加，诱发血管损伤和细胞增殖[8]。本研究发现，补体 C3、C5、C6、C8、补体因子H和B等补体相关蛋白在RRDCD组中显著上调。补体系统是体液免疫反应的主要组成部分，参与调节、炎症、溶解和免疫复合物的清除，激活后促进细胞吞噬、趋化和免疫黏附过程[9-10]。此外，凝血相关蛋白，凝血因子1、2、10、12，纤维蛋白原A2，抗纤溶酶和激肽释放酶在RRDCD组中显著富集。这可能由于视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮层物理分离创造了一个缺血环境，导致光感受器和神经元死亡，造成血视网膜屏障破坏，大量血浆蛋白渗出到玻璃体腔[11]。多种促炎因子如SAA4、胰蛋白酶抑制剂等多在RRDCD组中高表达，补体介导的炎症过程中产生的促炎因子可以上调血管内皮细胞表达，且血管内皮细胞具有启动、激活、放大及调控补体及凝血过程的作用，两者相互促进，最终加重RRDCD患者的炎症反应和凝血异常，造成组织进一步损伤[12]。
本研究首次分析了溶酶体相关通路和ECM紊乱对RRDCD的影响。溶酶体是维持细胞稳态和代谢平衡的关键调节剂，溶酶体通过内吞、吞噬和自噬等作用参与大分子的循环和清除，在组织分泌、细胞信号传导、基因调控、细胞黏附等过程发挥作用[13]。既往研究发现，溶酶体蛋白功能异常对细胞生长及发育造成不良影响[14-15]。本研究观察到RRDCD患者组蛋白V显著下调。组蛋白V是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，主要存在于角膜、胸腺和皮肤等组织[16-17]。既往研究表明，组蛋白V在角膜新生血管调节中发挥重要作用，并显示出抗血管生成的特性[18-19]。RRDCD患者组蛋白V下调可能促进新生血管形成，加剧血视网膜屏障的破坏。组蛋白V与弹性蛋白的细胞内降解有关，组蛋白V水平降低可破坏蛋白质水解过程，导致物质在组织内积聚并加剧物质从血管内的渗出，导致大量视网膜下液[20-21]。此外，与溶酶体硫酸化相关的艾杜糖酸2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖酸酶以及溶酶体α-葡萄糖苷酶在RRDCD组中显著下调，使得葡萄糖摄取和糖酵解破坏，能量来源减少，视网膜代谢活性减弱，进一步加重光感受器细胞死亡、视网膜细胞损伤以及血视网膜屏障的破坏[22-23]。
ECM是提供细胞所需的物理支撑，并通过信号传导影响细胞功能、形态和迁移[24-25]。ECM成分与特定细胞表面受体（如整合素、黏附素）之间相互作用促进信号传导，引发各种细胞反应。既往研究发现络丝蛋白（RELN）在视网膜形成过程中富集在视网膜神经节细胞（RGC）的轴突，参与视觉通路的突触连接[26]。RRDCD组RELN的缺乏可能使得RGC结构缺陷，导致视觉信号传输中断。此外，本研究发现，RRDCD组大量胶原蛋白表达异常。胶原蛋白下调和突变会导致转化生长因子（TGF）-β信号传导通路失调[27]。TGF-β信号通路主要调节细胞生长和增殖，细胞过度增殖造成组织纤维化，这解释了RRDCD患者大量视网膜下膜和纤维膜的原因。各种胶原蛋白的非胶原体（NC）结构域与血管生成有关[28]，如胶原蛋白Ⅳ的α1、α2、α3、α6链的NC1结构域可以通过蛋白水解释放，从而抑制血管生成[29-30]。胶原蛋白下调明显削弱了其抗血管作用。此外，胶原蛋白可以穿透玻璃体基底部视网膜内界膜，在黄斑和后极部表面与视网膜交联，稳定视网膜结构[31]。胶原蛋白下调与RRDCD更大范围的视网膜脱离和视网膜裂孔相关，胶原蛋白的减少使得组织间的黏附力减小，导致视网膜撕裂和脱离。
本研究存在的局限性与不足是研究主要采用玻璃体液进行蛋白质组学分析，因客观条件限制无法纳入正常视网膜组织进行研究。虽然玻璃体液和视网膜层间存在细胞的直接接触和物质交换，但通过玻璃体液进行蛋白质组学分析所识别的蛋白质仅部分反映了视网膜神经元的生物变化。
本研究探讨了RRDCD发生的独立危险因素，并进一步分析了RRDCD患者玻璃体液的蛋白质组学变化，证实补体与凝血级联激活与RRDCD的相关性，并首次提出RRDCD患者ECM重塑和溶酶体结构的改变也与疾病发生发展密切相关，为进一步阐明RRDCD的发病机制及干预策略提供了可能的新方向。
孔源性视网膜脱离（RRD）合并脉络膜脱离是一种特殊类型的RRD，通常伴随眼压降低、严重葡萄膜炎和血视网膜屏障破坏，预后较差[1]。年龄、高度近视、既往眼科手术史、多处视网膜撕裂等是其发生的危险因素[2]。关于RRDCD发病机制，一种假说认为低眼压是其始动因素，脉络膜血管在低眼压状态下失去支撑而扩张，血管屏障系统遭到破坏，使得富含蛋白质的液体渗出到脉络膜和睫状体上腔[3-4]。另一种理论认为，视网膜脱离后引起的眼内炎症刺激大量液体渗出至脉络膜和睫状体上腔促进脉络膜脱离[5]。但RRDCD的具体发病机制及分子学特征，目前仍无明确定论。蛋白质组学本质上是指在大规模水平上研究蛋白质的特征改变，以便在蛋白质层面获得对疾病更为全面的了解。近年发展的数据非依赖性采集（DIA）技术是将整个扫描范围分为多个窗口，依次选择碎裂采集所有母离子全部子离子的信息，生成更全面的二级质谱。与传统质谱技术比较，可以有效测定复杂样品中低丰度蛋白质，从而提高定量分析的可信度[6]。本研究采用DIA质谱技术，分析RRDCD患者玻璃体液蛋白质组学特征改变，初步探讨RRDCD的可能发病机制和病理过程。现将结果报道如下。
1 对象和方法
临床前瞻性横断面研究。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则，经武汉大学附属爱尔眼科医院伦理委员会审批（伦理审查号：2023IRBKY120901），并取得患者书面知情同意。
1.1 对象
2021年11月至2023年12月于武汉大学附属爱尔眼科医院检查确诊的RRDCD患者35例（RRDCD组）和RRD患者40例（RRD组）的玻璃体液标本纳入本研究。纳入标准：（1）临床检查确诊的原发性RRD和RRDCD；（2）未经任何治疗；（3）随访时间≥6个月。排除标准：（1）眼外伤等继发性RRD和RRDCD；（2）近期有口服糖皮质激素或眼部用药史；（3）合并糖尿病、高血压性视网膜病变以及年龄相关性黄斑变性；（4）既往有内眼手术史、葡萄膜炎、全身系统性疾病史者。
患者均行裂隙灯显微镜联合前置镜、最佳矫正视力（BCVA）、光相干断层扫描、超广角眼底成像、B型超声、超声生物显微镜检查以及眼轴长度（AL）测量。BCVA检查采用标准对数视力表进行，统计分析时转换为最小分辨角对数（logMAR）视力。将眼压＜10 mm Hg（1 mm Hg=0.133kPa）定义为低眼压。
1.2 标本制备
患者均行经睫状体平坦部三通道23G玻璃体切割手术（PPV）。手术由同一名资深眼底病外科医生完成。手术开始未开放眼内灌注前，切除并抽吸玻璃体液0.3～0.5 ml，移至1 ml微量离心管中，－80 °C冻存备用。1周内，简单随机抽样法分别选取RRDCD组、RRD组各4例行蛋白质组学分析；酶联免疫吸附试验（ELISA）验证3例。
玻璃体样品中加入裂解液[1%脱氧胆酸钠、100 mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH=8.5；10 mmol/L三（2-羧乙基）膦、40 mmol/L乙酰丙酮钙]，60 ℃孵育30 min进行还原烷基化反应。采用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白补齐至相同体积，加入等体积去离子水，将脱氧胆酸钠浓度稀释至0.5%以下，按照酶与蛋白1:50加入胰蛋白酶，37 ℃孵育振荡过夜进行酶切。次日加入三氟乙酸终止酶切，取上清进行脱盐柱脱盐，真空抽干后－20 ℃冻存。
1.3 质谱分析
采用美国赛默飞世尔科技公司UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱仪和德国布鲁克公司tims TOF Pro质谱仪进行质谱分析。肽段样品经自动进样器吸入后结合至Trap柱（75 μm × 20 mm，填料规格2 μm，100 A），洗脱至分析柱（75 μm × 250 mm，填料规格1.6 μm，100 A）进行分离。利用两个流动相建立分析梯度。液相流速设置为300 nl/min。肽段通过Captive Spray纳升离子源进入质谱进行扫描，开启TIMS功能，采用diaPASEF扫描模式。DIA窗口在tims Control软件中进行定义。每个扫描循环由1个MS1扫描和定义的diaPASEF扫描组成。
1.4 差异表达蛋白筛选及鉴定
筛选标准为RRDCD组与RRD组蛋白定量比值＞1.5，即差异倍数＞1.5和两组样品蛋白定量数据进行t检验计算所得P＜0.05筛选差异蛋白。
使用Uniprot中Human的蛋白质组参考数据库对质谱采集的原始数据进行数据库的搜索。通过DIA-NN中的深度学习算法预测一个谱图库，应用预测的谱图库和MBR功能得到的谱图库对DIA原始数据进行提取，得到蛋白定量信息。最终结果以1%错误发现率对母离子和蛋白水平进行筛选。
1.5 ELISA验证
采用简单随机抽样方法，对鉴定出的差异蛋白进行编号。采用电脑生成的随机数程序，随机选取3个差异表达蛋白行ELISA验证。
1.6 生物信息学分析
采用eggNOG-mapper软件对差异蛋白进行基因注释（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路显著性富集分析。GO功能富集分析包括生物进程、细胞组分、分子功能；KEGG通路显著性富集分析包括分子过程、外环境信息传递、人类疾病、新陈代谢、生物系统。分别选择富集程度最高的21、11个条目绘制富集直方图和气泡图。
1.7 统计学分析
采用SPSS26.0软件行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示；组间比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。计数资料以百分率（%）表示；组间比较采用χ2检验。将单因素分析中P＜0.05的因素纳入二元logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者临床特征
RRDCD组、RRD组患者间年龄、性别构成比、发病时间、高度近视率、裂孔累及黄斑、裂孔位置比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；眼压、裂孔数量、视网膜脱离范围、AL、手术后增生性玻璃体视网膜病变（PVR）发生率、一次手术复位率、手术后6个月logMAR BCVA比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1
RRDCD组、RRD组患者基线资料比较
Logistic回归分析结果显示，眼压、AL、视网膜脱离范围、视网膜裂孔数量是RRDCD发生的独立危险因素（表2）。
表2
二元logistic回归分析结果
2.2 差异表达蛋白分析
RRDCD组、RRD组样本相关系数多数位于0.7～1.0，相关性较强，数据可重复性较高（图1A）；样本组成相似性良好（图1B）；蛋白质表达水平具有明显差异（图1C）。
图1
RRDCD组、RRD组定量蛋白质组学分析
1A示两组差异蛋白Pearson相关系数；1B示两组样本中所含蛋白质定量韦恩图，上图、下图分别代表RRD组、RRDCD组蛋白质数量；1C示两组差异蛋白聚类热图，红色越深表示差异表达蛋白表达水平越高，蓝色越深表示差异表达蛋白表达水平越低 RRD：孔源性视网膜脱离；RRDCD：RRD合并脉络膜脱离
RRDCD组、RRD组玻璃体液标本中蛋白质浓度分别为（5.84±1.12）、（2.36±1.96）μg/μl，差异有统计学意义（t=3.083，P=0.01）。两组间共筛选出237个差异表达蛋白，其中上调、下调蛋白分别为63、174个。排名前10的上调蛋白为α-胰蛋白酶抑制剂（ITHI1）、载脂蛋白L1、血清淀粉样蛋白（SAA4）、分泌型磷蛋白、玻连蛋白（VTN）等；下调蛋白为二甲基精氨酸二甲胺水解酶、粘附G蛋白偶联受体、组蛋白酶H等（表3）。
表3
RRDCD组、RRD组间排名前10的差异表达蛋白
2.3 ELISA验证质谱结果的可靠性
ELISA验证结果显示，随机选取的3个差异表达蛋白在RRDCD组和RRD之间的表达变化趋势均与DIA质谱分析结果一致（图2）。
图2
随机选择的3个差异表达蛋白的ELISA验证结果（n=3）
2A～2C分别示ITHI1、SAA4、VTN，**
2.4 生物信息学分析
GO功能富集分析结果显示，237个差异表达蛋白与不同的生物学进程、分子功能和细胞组分有关。生物进程方面，差异表达蛋白显著富集在多细胞生物发育、血浆脂蛋白颗粒组织及清除、解剖结构发育等；分子功能方面，差异表达蛋白显著富集在细胞外环境、基质、蛋白质-脂质复合物、内膜系统等；细胞成分方面，差异表达蛋白显著富集在脂质转运体活性、受体调节剂活性、酶调节剂活性等（图3）。与RRD组比较，RRDCD组差异表达蛋白显著富集于生物及细胞黏附、补体激活、细胞收缩、脂质代谢过程相关蛋白质。这些蛋白质主要分布在细胞膜、细胞基质和细胞外环境中。
图3
GO功能富集分析结果图
3A示直方图，柱线代表富集GO条目的
KEGG信号通路富集分析结果显示，237个差异蛋白富集于11条代谢通路（图4，表4）。其中，20个差异表达蛋白富集于补体和凝血级联通路；16个差异表达蛋白富集于溶酶体通路；13个差异表达蛋白富集于细胞外环境-受体相互作用和人乳头瘤病毒感染通路。
图4
KEGG信号通路富集分析结果图
4A示直方图，柱线代表富集通路KEGG条目的
表4
差异表达蛋白KEGG通路富集结果
3 讨论
目前蛋白质组学研究主要针对PVR、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变，而对于RRDCD研究则相对较少。既往研究发现，相较于视网膜前膜，RRDCD患者玻璃体液中鉴定出249种差异表达蛋白，上调蛋白主要涉及炎症及补体免疫反应[7]。本研究采用精确度更高的DIA质谱技术鉴定RRD、RRDCD患者玻璃体液中蛋白质表达变化，共发现237种差异表达蛋白，其中上调、下调蛋白分别为63、174种。具有差异表达的蛋白质与细胞迁移、补体成分和细胞黏附等生物过程相关；通路富集分析发现，补体与凝血级联、溶酶体通路和细胞外基质（ECM）重塑在RRDCD发挥重要作用。ELISA证实VTN、ITHI1、SAA4水平上调，与DIA蛋白质组学结果一致。
既往研究发现，RRDCD中炎症和免疫反应促进补体成分激活，引起视网膜血管通透性增加，诱发血管损伤和细胞增殖[8]。本研究发现，补体 C3、C5、C6、C8、补体因子H和B等补体相关蛋白在RRDCD组中显著上调。补体系统是体液免疫反应的主要组成部分，参与调节、炎症、溶解和免疫复合物的清除，激活后促进细胞吞噬、趋化和免疫黏附过程[9-10]。此外，凝血相关蛋白，凝血因子1、2、10、12，纤维蛋白原A2，抗纤溶酶和激肽释放酶在RRDCD组中显著富集。这可能由于视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮层物理分离创造了一个缺血环境，导致光感受器和神经元死亡，造成血视网膜屏障破坏，大量血浆蛋白渗出到玻璃体腔[11]。多种促炎因子如SAA4、胰蛋白酶抑制剂等多在RRDCD组中高表达，补体介导的炎症过程中产生的促炎因子可以上调血管内皮细胞表达，且血管内皮细胞具有启动、激活、放大及调控补体及凝血过程的作用，两者相互促进，最终加重RRDCD患者的炎症反应和凝血异常，造成组织进一步损伤[12]。
本研究首次分析了溶酶体相关通路和ECM紊乱对RRDCD的影响。溶酶体是维持细胞稳态和代谢平衡的关键调节剂，溶酶体通过内吞、吞噬和自噬等作用参与大分子的循环和清除，在组织分泌、细胞信号传导、基因调控、细胞黏附等过程发挥作用[13]。既往研究发现，溶酶体蛋白功能异常对细胞生长及发育造成不良影响[14-15]。本研究观察到RRDCD患者组蛋白V显著下调。组蛋白V是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，主要存在于角膜、胸腺和皮肤等组织[16-17]。既往研究表明，组蛋白V在角膜新生血管调节中发挥重要作用，并显示出抗血管生成的特性[18-19]。RRDCD患者组蛋白V下调可能促进新生血管形成，加剧血视网膜屏障的破坏。组蛋白V与弹性蛋白的细胞内降解有关，组蛋白V水平降低可破坏蛋白质水解过程，导致物质在组织内积聚并加剧物质从血管内的渗出，导致大量视网膜下液[20-21]。此外，与溶酶体硫酸化相关的艾杜糖酸2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖酸酶以及溶酶体α-葡萄糖苷酶在RRDCD组中显著下调，使得葡萄糖摄取和糖酵解破坏，能量来源减少，视网膜代谢活性减弱，进一步加重光感受器细胞死亡、视网膜细胞损伤以及血视网膜屏障的破坏[22-23]。
ECM是提供细胞所需的物理支撑，并通过信号传导影响细胞功能、形态和迁移[24-25]。ECM成分与特定细胞表面受体（如整合素、黏附素）之间相互作用促进信号传导，引发各种细胞反应。既往研究发现络丝蛋白（RELN）在视网膜形成过程中富集在视网膜神经节细胞（RGC）的轴突，参与视觉通路的突触连接[26]。RRDCD组RELN的缺乏可能使得RGC结构缺陷，导致视觉信号传输中断。此外，本研究发现，RRDCD组大量胶原蛋白表达异常。胶原蛋白下调和突变会导致转化生长因子（TGF）-β信号传导通路失调[27]。TGF-β信号通路主要调节细胞生长和增殖，细胞过度增殖造成组织纤维化，这解释了RRDCD患者大量视网膜下膜和纤维膜的原因。各种胶原蛋白的非胶原体（NC）结构域与血管生成有关[28]，如胶原蛋白Ⅳ的α1、α2、α3、α6链的NC1结构域可以通过蛋白水解释放，从而抑制血管生成[29-30]。胶原蛋白下调明显削弱了其抗血管作用。此外，胶原蛋白可以穿透玻璃体基底部视网膜内界膜，在黄斑和后极部表面与视网膜交联，稳定视网膜结构[31]。胶原蛋白下调与RRDCD更大范围的视网膜脱离和视网膜裂孔相关，胶原蛋白的减少使得组织间的黏附力减小，导致视网膜撕裂和脱离。
本研究存在的局限性与不足是研究主要采用玻璃体液进行蛋白质组学分析，因客观条件限制无法纳入正常视网膜组织进行研究。虽然玻璃体液和视网膜层间存在细胞的直接接触和物质交换，但通过玻璃体液进行蛋白质组学分析所识别的蛋白质仅部分反映了视网膜神经元的生物变化。
本研究探讨了RRDCD发生的独立危险因素，并进一步分析了RRDCD患者玻璃体液的蛋白质组学变化，证实补体与凝血级联激活与RRDCD的相关性，并首次提出RRDCD患者ECM重塑和溶酶体结构的改变也与疾病发生发展密切相关，为进一步阐明RRDCD的发病机制及干预策略提供了可能的新方向。
