引用本文： 李文博, 曹靖靖, 庄彤彤, 王晴, 东莉洁. 骨形成蛋白4调控视网膜色素上皮细胞迁移. 中华眼底病杂志, 2024, 40(3): 208-214. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230217-00069 复制
版权信息： ©四川大学华西医院华西期刊社《中华眼底病杂志》版权所有，未经授权不得转载、改编
糖尿病视网膜病变（DR）的晚期阶段即增生型DR（PDR）主要特征是玻璃体视网膜交界处形成纤维化膜[1-2]。氧化应激可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖、迁移及细胞外基质的分泌从而触发上皮-间充质转化（EMT），导致纤维增生膜形成[3]。骨形成蛋白4（BMP-4）家族是转化生长因子-β（TGF-β）家族中重要的亚家族，在细胞增殖、分化等方面发挥重要作用且在眼部病理纤维化状态下升高[4-5]。本课题组既往研究表明，BMP4在抗血管内皮生长因子（VEGF）和纤维化方面的作用有助于延缓DR进展[6]。因此，本研究以BMP4为切入点，初步探讨氧化应激条件下BMP4在RPE细胞中的表达以及可能涉及的作用，以期为延缓PDR的进展提供新的思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RPE细胞（ARPE-19）由本实验室自行保存。小干扰RNA（siRNA，河马生物科技有限公司）；4-羟基壬烯醛（4-HNE）（美国Sigma公司）；噻唑蓝（MTT）增生检测试剂盒（瑞士Roche公司）；兔源BMP4抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、Alexa Fluor 488标记的荧光二抗（英国Abcam公司）； 线粒体活性氧（MitoSOX，上海碧云天生物技术有限公司）；Mito指示剂［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］。
1.2 方法
细胞培养和分组。ARPE-19置于含10%胎牛血清和1%双抗的DF-12培养基常规培养[7]。细胞分为正常组、单纯4-HNE处理组（4-HNE组）、4-HNE+空白对照组（4-HNE+NC组）、4-HNE+小干扰BMP4（siBMP4）组（4-HNE+siBMP4组）。4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE[8]；4-HNE+NC组同时加入空白siRNA（2.5 nmol/L）为小干扰阴性对照，4-HNE+siBMP4组同时加入siBMP4（5.0 nmol/L）诱导。正常组细胞常规培养。
MTT比色法检测4-HNE对RPE细胞增殖的影响。细胞密度达到70%～80%时，胰酶消化细胞，以1×104个/ml的密度接种于96孔板中。4-HNE组加入4-HNE诱导细胞6 h后，每孔加入110 µl MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h后每孔加入150 μl二甲基亚砜。采用酶链免疫检测仪测量波长490 nm处的吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。每组设3个复孔，实验重复3次。
细胞划痕实验测定4-HNE、BMP4对RPE细胞迁移能力的影响。细胞密度达到70%～80%时，胰酶消化细胞，以6×105个/ml的细胞密度接种于96孔板中。于孔板中央作“十”字状划痕，并将此时计作0 h，继续培养6 h后在相同划痕位置拍照记录。应用ImageJ软件计算细胞迁移面积，迁移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸区面积；St：各时间点裸区面积）。每组设3个复孔，实验重复3次。
Transwell小室法检测4-HNE对RPE细胞迁移能力的影响。无血清培养基以5×105个/孔细胞接种于Transwell小室上室内，下室加入100%胎牛血清；细胞培养板置于孵箱中培育6 h，多聚甲醛固定下室表面细胞20 min，棉签擦去小室上层未向下迁移的细胞，常规结晶紫染色30 min。光学显微镜下观察拍照。每组随机选取6～8个视野以计数小室底膜上、下室侧附着的细胞，即为发生迁移的细胞数。每组各设3个复孔，重复3次。
实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中BMP4 mRNA相对表达量。应用Express 3.0软件设计引物序列。384孔板中依此加入2 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合，以离心半径7 cm、1 500 r/min离心5 min。qRT-PCR反应条件：50 ℃反应2 min，95 ℃变性10 min（1个循环）；95 ℃变性15 s（40个循环）；55 ℃扩增30 s；95 ℃反应15 s；60 ℃反应15 s，95 ℃ 反应15 s。置于qRT-PCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct值），以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，依照公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。
蛋白质免疫印迹法（Western blots）检测细胞中BMP4 蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度[9]。每个样孔加入20 μl待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V 恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h。10%脱脂牛奶封闭，1:1 000 一抗4 ℃孵育24 h（GAPDH 作为阳性对照），磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜10 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，重复5次； 加入化学发光剂，暗室曝光。
荧光显微镜拍照观察小干扰转染效率。生长状态良好的RPE细胞以1×104个/ml的密度接种于48孔板中，细胞密度约为30%～50%时加入浓度为10 nmol/L的siBMP4转染试剂，转染24 h，荧光显微镜拍照。
MitoSOX荧光探针检测细胞内MitoSOX水平。生长状态良好的RPE细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板中，细胞密度约为80%时对各组细胞进行处理后，与含有5 μmol/L Mito-Sox和100 nmol/L MitoTracker的30 μl PBS于37 °C下孵育10 min，流式细胞仪检测MitoSOX表达情况。
免疫荧光实验检测细胞内EMT标志物钙粘蛋白E（E-cadherin）和纤维连接蛋白（Fibronection）的表达。细胞培养板中每孔滴加4%多聚甲醛对细胞进行固定，时间20 min。PBS洗细胞3次，5 min/次。加入0.1% QuickBlock™封闭液（PBSTX），孵育20 min；再次PBS洗细胞3次，5 min/次。各组细胞置于封闭液（1%牛血清白蛋白、10%山羊血清、0.3 mol/L甘氨酸）和0.1% PBSTX中封闭2 h；PBS洗细胞3次，5 min/次。加入BMP4抗体进行孵化，4 ℃过夜孵育。PBS洗细胞3次，10 min/次；加入Alexa Fluor 488标记的荧光二抗孵育1 h，样本PBS洗3次，10 min/次。加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚封片剂，荧光显微镜下观察拍照。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析。采用Graph-prism软件对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
与正常组比较，4-HNE组细胞增殖能力、迁移能力明显增强，差异均有统计学意义（t=21.619、24.469，P＜0.05）（图1）。
图1
细胞氧化应激模型建立成功（n=3）
1A示正常组、4-HNE组细胞增殖能力比较，
与正常组比较，4-HNE组细胞中BMP4表达明显升高，差异有统计学意义（t=19.441，P＜0.05）（图2A）；BMP4 mRNA、蛋白相对表达量亦显著升高，差异均有统计学意义（t=26.163、37.163，P＜0.05）（图2B，2C）。
图2
氧化应激条件下BMP4水平检测（n=3）
2A示电泳图；2B、2C分别示两组BMP4蛋白、mRNA相对表达量比较，*
荧光显微镜拍照观察结果显示，转染siBMP4 24 h后，RPE细胞中BMP4转染效率＞90%（图3A）。与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+siBMP4组细胞中BMP4蛋白、mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（F=27.241、36.943，P＜0.05）（图3B～3C）。
图3
siBMP4转染效率验证（n=3）
3A示RPE细胞荧光显微镜像（标尺：200 μm），转染siBMP4 24 h后，BMP4转染效率＞90%。3B、3C分别示4组BMP4蛋白、mRNA相对表达量比较，1、2、3、4分别示正常组、4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，*
细胞划痕实验结果显示，细胞培养24 h后，正常组、4-HNE+siBMP4组仅有少量细胞迁移进入裸区，4-HNE组、4-HNE+NC组可见大量细胞迁移进入裸区（图4A～4D）。与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+siBMP4组细胞迁移率明显降低，差异有统计学意义（F=46.723，P＜0.001）（图4E）。
图4
BMP4对RPE细胞迁移能力的影响（n=3）
4A～4D分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+ NC组、4-HNE+siBMP4组细胞培养24 h倒置相差显微镜像（标尺：200 μm），正常组、4-HNE+siBMP4组仅有少量细胞迁移进入裸区，4-HNE组、4-HNE+NC组可见大量细胞迁移进入裸区；4E示4组细胞迁移率比较，1、2、3、4分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，***
流式细胞仪检测结果显示，与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+siBMP4组细胞内MitoSOX表达水平显著降低，差异有统计学意义（F=39.721，P＜0.01）（图5）。
图5
BMP4对RPE细胞MitoSOX的影响（n=3）
5A～5D分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+ NC组、4-HNE+siBMP4组流式细胞仪检测像；5E示4组细胞内MitoSOX表达量比较，1、2、3、4分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，**
免疫荧光实验检测结果显示，与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+ siBMP4组细胞内上皮标志物E-cadherin显著增多，间充质标志物Fibronection显著减少，差异均有统计学意义（F=51.722、45.153，P＜0.05）（图6）。
图6
BMP4对RPE细胞中EMT标志物的影响（n=3）
6A～6D分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组荧光显微镜像（标尺：50 μm），E-cadherin呈绿色荧光表达；6E示4组E-cadherin表达水平比较，1、2、3、4分别示正常组、4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，*
3 讨论
PDR被认为是一种异常的伤口愈合反应，主要由炎症、视网膜和RPE细胞驱动[10]。手术是目前 PDR治疗的唯一选择，但PDR复发性仍然是手术成功的重要限制因素[11]。因此，临床亟待寻求新的靶点延缓PDR进展。
RPE细胞病理反应在PDR过程中起着关键作用。正常生理条件下，RPE细胞通过细胞间的连接蛋白如E-cadherin紧密连接，而不发生增殖和迁移，并且会维持表型的稳定；而在氧化应激等病理条件下，可发生E-cadherin等连接蛋白的表达降低，而间充质标志物如Fibronection表达上调，引起RPE细胞的增殖、迁移，并被触发进入EMT过程，最终转化为肌成纤维细胞，参与纤维增生膜的形成，引发PDR[12]。本研究结果显示，氧化应激条件下RPE细胞中E-cadherin表达下调和Fibronection表达上调，细胞发生增殖、迁移，提示氧化应激可诱导RPE细胞的EMT，与纤维化的发生相关。
越来越多的证据表明，PDR的发生与氧化应激有关，可引发RPE细胞线粒体功能障碍[13-14]。氧化应激反应会产生脂质过氧化产物，4-HNE是重要的一种脂质过氧化产物，既会诱导细胞凋亡，也可诱导细胞增殖，且与其浓度相关[15]。本研究首先建立氧化应激细胞模型，以模拟RPE细胞病理过程。结果显示，在10 μmmol/L 4-HNE诱导下，RPE发生增殖和迁移，提示其氧化应激模型建立成功。TGF-β是已知诱导RPE细胞EMT的关键生长因子，并且在PDR患者中以高水平存在[16]。BMP4作为TGF-β家族中的一员，在多种生命活动中发挥重要作用[17]。有文献报道，BMP4可以诱导肾脏发生EMT而引发纤维化[18-19]。此外，BMP4还诱导RPE细胞分泌胎盘生长因子，促进细胞迁移参与纤维血管膜的形成[20]。本课题组前期研究发现，高糖和氧化应激环境均可诱导血管内皮细胞BMP4的高表达[21-22]。且在DR中，RPE细胞内BMP4蛋白、mRNA表达水平均增加[6]。因此，我们推测RPE细胞增殖和迁移可能与BMP4相关。
本研究结果显示，氧化应激条件下BMP4表达升高；沉默BMP4表达后，RPE细胞增殖、迁移及MitoSOX的产生均受到抑制，且上皮标志物E-cadherin表达上调，间充质标志物Fibronection表达下调。这提示BMP4参与RPE细胞的EMT发生，与PDR的发病相关。
本研究初步明确BMP4在RPE细胞中的作用，但尚未进行深入机制研究，未来将进一步探究BMP4在PDR发病中可能发挥的潜在作用。鉴于TGF-β/Smad通路是调控EMT的经典通路，且本课题组既往研究观察了BMP4/Smad9在视网膜血管内皮细胞中的作用，接下来我们将会把研究重心放在BMP4/Smad9对RPE细胞的调控作用上，为延缓PDR的进展提供生物学依据。
糖尿病视网膜病变（DR）的晚期阶段即增生型DR（PDR）主要特征是玻璃体视网膜交界处形成纤维化膜[1-2]。氧化应激可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖、迁移及细胞外基质的分泌从而触发上皮-间充质转化（EMT），导致纤维增生膜形成[3]。骨形成蛋白4（BMP-4）家族是转化生长因子-β（TGF-β）家族中重要的亚家族，在细胞增殖、分化等方面发挥重要作用且在眼部病理纤维化状态下升高[4-5]。本课题组既往研究表明，BMP4在抗血管内皮生长因子（VEGF）和纤维化方面的作用有助于延缓DR进展[6]。因此，本研究以BMP4为切入点，初步探讨氧化应激条件下BMP4在RPE细胞中的表达以及可能涉及的作用，以期为延缓PDR的进展提供新的思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RPE细胞（ARPE-19）由本实验室自行保存。小干扰RNA（siRNA，河马生物科技有限公司）；4-羟基壬烯醛（4-HNE）（美国Sigma公司）；噻唑蓝（MTT）增生检测试剂盒（瑞士Roche公司）；兔源BMP4抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、Alexa Fluor 488标记的荧光二抗（英国Abcam公司）； 线粒体活性氧（MitoSOX，上海碧云天生物技术有限公司）；Mito指示剂［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］。
1.2 方法
细胞培养和分组。ARPE-19置于含10%胎牛血清和1%双抗的DF-12培养基常规培养[7]。细胞分为正常组、单纯4-HNE处理组（4-HNE组）、4-HNE+空白对照组（4-HNE+NC组）、4-HNE+小干扰BMP4（siBMP4）组（4-HNE+siBMP4组）。4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE[8]；4-HNE+NC组同时加入空白siRNA（2.5 nmol/L）为小干扰阴性对照，4-HNE+siBMP4组同时加入siBMP4（5.0 nmol/L）诱导。正常组细胞常规培养。
MTT比色法检测4-HNE对RPE细胞增殖的影响。细胞密度达到70%～80%时，胰酶消化细胞，以1×104个/ml的密度接种于96孔板中。4-HNE组加入4-HNE诱导细胞6 h后，每孔加入110 µl MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h后每孔加入150 μl二甲基亚砜。采用酶链免疫检测仪测量波长490 nm处的吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。每组设3个复孔，实验重复3次。
细胞划痕实验测定4-HNE、BMP4对RPE细胞迁移能力的影响。细胞密度达到70%～80%时，胰酶消化细胞，以6×105个/ml的细胞密度接种于96孔板中。于孔板中央作“十”字状划痕，并将此时计作0 h，继续培养6 h后在相同划痕位置拍照记录。应用ImageJ软件计算细胞迁移面积，迁移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸区面积；St：各时间点裸区面积）。每组设3个复孔，实验重复3次。
Transwell小室法检测4-HNE对RPE细胞迁移能力的影响。无血清培养基以5×105个/孔细胞接种于Transwell小室上室内，下室加入100%胎牛血清；细胞培养板置于孵箱中培育6 h，多聚甲醛固定下室表面细胞20 min，棉签擦去小室上层未向下迁移的细胞，常规结晶紫染色30 min。光学显微镜下观察拍照。每组随机选取6～8个视野以计数小室底膜上、下室侧附着的细胞，即为发生迁移的细胞数。每组各设3个复孔，重复3次。
实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞中BMP4 mRNA相对表达量。应用Express 3.0软件设计引物序列。384孔板中依此加入2 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合，以离心半径7 cm、1 500 r/min离心5 min。qRT-PCR反应条件：50 ℃反应2 min，95 ℃变性10 min（1个循环）；95 ℃变性15 s（40个循环）；55 ℃扩增30 s；95 ℃反应15 s；60 ℃反应15 s，95 ℃ 反应15 s。置于qRT-PCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct值），以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，依照公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。
蛋白质免疫印迹法（Western blots）检测细胞中BMP4 蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度[9]。每个样孔加入20 μl待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V 恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h。10%脱脂牛奶封闭，1:1 000 一抗4 ℃孵育24 h（GAPDH 作为阳性对照），磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜10 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，重复5次； 加入化学发光剂，暗室曝光。
荧光显微镜拍照观察小干扰转染效率。生长状态良好的RPE细胞以1×104个/ml的密度接种于48孔板中，细胞密度约为30%～50%时加入浓度为10 nmol/L的siBMP4转染试剂，转染24 h，荧光显微镜拍照。
MitoSOX荧光探针检测细胞内MitoSOX水平。生长状态良好的RPE细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板中，细胞密度约为80%时对各组细胞进行处理后，与含有5 μmol/L Mito-Sox和100 nmol/L MitoTracker的30 μl PBS于37 °C下孵育10 min，流式细胞仪检测MitoSOX表达情况。
免疫荧光实验检测细胞内EMT标志物钙粘蛋白E（E-cadherin）和纤维连接蛋白（Fibronection）的表达。细胞培养板中每孔滴加4%多聚甲醛对细胞进行固定，时间20 min。PBS洗细胞3次，5 min/次。加入0.1% QuickBlock™封闭液（PBSTX），孵育20 min；再次PBS洗细胞3次，5 min/次。各组细胞置于封闭液（1%牛血清白蛋白、10%山羊血清、0.3 mol/L甘氨酸）和0.1% PBSTX中封闭2 h；PBS洗细胞3次，5 min/次。加入BMP4抗体进行孵化，4 ℃过夜孵育。PBS洗细胞3次，10 min/次；加入Alexa Fluor 488标记的荧光二抗孵育1 h，样本PBS洗3次，10 min/次。加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚封片剂，荧光显微镜下观察拍照。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析。采用Graph-prism软件对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
与正常组比较，4-HNE组细胞增殖能力、迁移能力明显增强，差异均有统计学意义（t=21.619、24.469，P＜0.05）（图1）。
图1
细胞氧化应激模型建立成功（n=3）
1A示正常组、4-HNE组细胞增殖能力比较，
与正常组比较，4-HNE组细胞中BMP4表达明显升高，差异有统计学意义（t=19.441，P＜0.05）（图2A）；BMP4 mRNA、蛋白相对表达量亦显著升高，差异均有统计学意义（t=26.163、37.163，P＜0.05）（图2B，2C）。
图2
氧化应激条件下BMP4水平检测（n=3）
2A示电泳图；2B、2C分别示两组BMP4蛋白、mRNA相对表达量比较，*
荧光显微镜拍照观察结果显示，转染siBMP4 24 h后，RPE细胞中BMP4转染效率＞90%（图3A）。与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+siBMP4组细胞中BMP4蛋白、mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（F=27.241、36.943，P＜0.05）（图3B～3C）。
图3
siBMP4转染效率验证（n=3）
3A示RPE细胞荧光显微镜像（标尺：200 μm），转染siBMP4 24 h后，BMP4转染效率＞90%。3B、3C分别示4组BMP4蛋白、mRNA相对表达量比较，1、2、3、4分别示正常组、4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，*
细胞划痕实验结果显示，细胞培养24 h后，正常组、4-HNE+siBMP4组仅有少量细胞迁移进入裸区，4-HNE组、4-HNE+NC组可见大量细胞迁移进入裸区（图4A～4D）。与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+siBMP4组细胞迁移率明显降低，差异有统计学意义（F=46.723，P＜0.001）（图4E）。
图4
BMP4对RPE细胞迁移能力的影响（n=3）
4A～4D分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+ NC组、4-HNE+siBMP4组细胞培养24 h倒置相差显微镜像（标尺：200 μm），正常组、4-HNE+siBMP4组仅有少量细胞迁移进入裸区，4-HNE组、4-HNE+NC组可见大量细胞迁移进入裸区；4E示4组细胞迁移率比较，1、2、3、4分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，***
流式细胞仪检测结果显示，与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+siBMP4组细胞内MitoSOX表达水平显著降低，差异有统计学意义（F=39.721，P＜0.01）（图5）。
图5
BMP4对RPE细胞MitoSOX的影响（n=3）
5A～5D分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+ NC组、4-HNE+siBMP4组流式细胞仪检测像；5E示4组细胞内MitoSOX表达量比较，1、2、3、4分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，**
免疫荧光实验检测结果显示，与4-HNE组、4-HNE+NC组比较，正常组、4-HNE+ siBMP4组细胞内上皮标志物E-cadherin显著增多，间充质标志物Fibronection显著减少，差异均有统计学意义（F=51.722、45.153，P＜0.05）（图6）。
图6
BMP4对RPE细胞中EMT标志物的影响（n=3）
6A～6D分别示正常组、 4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组荧光显微镜像（标尺：50 μm），E-cadherin呈绿色荧光表达；6E示4组E-cadherin表达水平比较，1、2、3、4分别示正常组、4-HNE组、4-HNE+NC组、4-HNE+siBMP4组，*
3 讨论
PDR被认为是一种异常的伤口愈合反应，主要由炎症、视网膜和RPE细胞驱动[10]。手术是目前 PDR治疗的唯一选择，但PDR复发性仍然是手术成功的重要限制因素[11]。因此，临床亟待寻求新的靶点延缓PDR进展。
RPE细胞病理反应在PDR过程中起着关键作用。正常生理条件下，RPE细胞通过细胞间的连接蛋白如E-cadherin紧密连接，而不发生增殖和迁移，并且会维持表型的稳定；而在氧化应激等病理条件下，可发生E-cadherin等连接蛋白的表达降低，而间充质标志物如Fibronection表达上调，引起RPE细胞的增殖、迁移，并被触发进入EMT过程，最终转化为肌成纤维细胞，参与纤维增生膜的形成，引发PDR[12]。本研究结果显示，氧化应激条件下RPE细胞中E-cadherin表达下调和Fibronection表达上调，细胞发生增殖、迁移，提示氧化应激可诱导RPE细胞的EMT，与纤维化的发生相关。
越来越多的证据表明，PDR的发生与氧化应激有关，可引发RPE细胞线粒体功能障碍[13-14]。氧化应激反应会产生脂质过氧化产物，4-HNE是重要的一种脂质过氧化产物，既会诱导细胞凋亡，也可诱导细胞增殖，且与其浓度相关[15]。本研究首先建立氧化应激细胞模型，以模拟RPE细胞病理过程。结果显示，在10 μmmol/L 4-HNE诱导下，RPE发生增殖和迁移，提示其氧化应激模型建立成功。TGF-β是已知诱导RPE细胞EMT的关键生长因子，并且在PDR患者中以高水平存在[16]。BMP4作为TGF-β家族中的一员，在多种生命活动中发挥重要作用[17]。有文献报道，BMP4可以诱导肾脏发生EMT而引发纤维化[18-19]。此外，BMP4还诱导RPE细胞分泌胎盘生长因子，促进细胞迁移参与纤维血管膜的形成[20]。本课题组前期研究发现，高糖和氧化应激环境均可诱导血管内皮细胞BMP4的高表达[21-22]。且在DR中，RPE细胞内BMP4蛋白、mRNA表达水平均增加[6]。因此，我们推测RPE细胞增殖和迁移可能与BMP4相关。
本研究结果显示，氧化应激条件下BMP4表达升高；沉默BMP4表达后，RPE细胞增殖、迁移及MitoSOX的产生均受到抑制，且上皮标志物E-cadherin表达上调，间充质标志物Fibronection表达下调。这提示BMP4参与RPE细胞的EMT发生，与PDR的发病相关。
本研究初步明确BMP4在RPE细胞中的作用，但尚未进行深入机制研究，未来将进一步探究BMP4在PDR发病中可能发挥的潜在作用。鉴于TGF-β/Smad通路是调控EMT的经典通路，且本课题组既往研究观察了BMP4/Smad9在视网膜血管内皮细胞中的作用，接下来我们将会把研究重心放在BMP4/Smad9对RPE细胞的调控作用上，为延缓PDR的进展提供生物学依据。
