引用本文： 周玲玲, 童妍, 严江波, 沈吟. 精母细胞相关蛋白基因变异致象限性视网膜色素变性伴黄斑营养不良一家系临床表型及基因型分析. 中华眼底病杂志, 2022, 38(8): 643-649. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211206-00683 复制
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视网膜色素变性（RP）是一组具有高度遗传异质性的神经退行性疾病，以夜盲、视野缺损及视网膜变性为主要特征[1]。其眼底常表现为骨细胞样色素沉着、视网膜血管变细及视盘颜色蜡黄等。象限性RP（sector RP）是一种罕见的非典型性RP，以常染色体显性遗传居多，双眼视网膜变性对称，主要局限于1～2个象限，以下方（尤其鼻下方）视网膜为主，对应上方视野缺损[2-3]；病变保持静止或进展缓慢，常可保存较好的中心视力[4]，有文献报道82%的sector RP患者视力≥0.5[5]。基因突变是sector RP发病的主要危险因素，目前已证实与sector RP相关的致病基因11个[6]，遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X染色体连锁遗传。目前针对sector RP的研究较少且不够深入，其致病机制仍不清楚。精母细胞相关蛋白7（SPATA7，OMIM: 609868）基因，位于染色体14q31.3，包含12个外显子，编码599个氨基酸的蛋白质，在进化中高度保守，依据3号外显子的可变剪接编码2种蛋白亚型，其中包含3号外显子编码的亚型主要表达于视网膜和脑[7]，对光感受器内外节的物质运输起着重要作用。其突变与常染色体隐性Leber先天性黑矇（LCA）和青少年性RP有关[8]；此外，还可造成锥杆细胞营养不良（CRD）[9]。本研究对由SPATA7基因所致sector RP的1个家系的基因型和临床表型进行分析，以期为进一步对特定基因的潜在致病机制及治疗方案的研究提供新线索。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，经武汉大学人民医院伦理委员会审批（批准号：WDRY2019-K032）；受检者及监护人均获知情并签署书面知情同意书。
2021年4月于武汉大学人民医院眼科就诊的1个sector RP家系中先证者及其父母纳入研究。详细询问患者病史和家族史，并行最佳矫正视力（BCVA）、眼底彩色照相、自身荧光（AF）、视野、频域光相干断层扫描（SD-OCT）、视网膜电图（ERG）、荧光素眼底血管造影（FFA）、吲哚青绿血管造影（ICGA）检查。
采集先证者及其父母外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德国Qiagen公司QiAamp® Blood Mini Kit试剂盒按照标准操作流程提取全基因组DNA，应用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000分光光度计对基因组DNA质量和数量进行评估。采用美国NEB公司NEBNext dsDNA Fragmentase打碎DNA序列，美国IDT公司xGen® Exome Research Panel v1.0试剂盒对DNA目标区域进行捕获，建立DNA文库；采用美国Illumina公司Illumina NovaSeq6000高通量测序仪对DNA样本进行测序。测序数据处理包括序列生成、序列比对（GRCh37）、变异识别（包括单核苷酸突变、删除和插入变异）、变异筛选、变异注释、变异优化，所有确定变异的致病性预测根据美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）指南[10]进行评估。
采用拷贝数变异（CNV）kit试剂盒检测CNV，CNV参考序列由内部样本建立。CNV识别中，采用循环二元分割算法对CNV变异进行分割，阈值参数设置为“－1.6、－0.8、0.5、1.0”。拷贝数结果以log2拷贝率的计算值呈现；B等位基因频率由Samtools的mpileup计算得出，利用AnnotSV及其注释数据库对检测到的CNV进行注释。
对SPATA7错义突变采用Sanger测序并进行家系共分离验证。Sanger测序中，应用Primer 5.0引物设计软件设计引物，以基因组DNA为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增含有变异的外显子片段，对PCR扩增的目的DNA片段进行纯化并测序，Chromas软件分析测序结果。CNV采用实时定量PCR（qPCR）进行验证，美国Thermo Fisher Scientific公司Applied Biosystems™ 7500 qPCR系统进行qPCR反应。
致病变异位点筛选原则：外显子测序项目（ESP）数据库（https://esp.gs.washington.edu/drupal/）、筛选ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）、千人基因组计划数据库（http://www.1000genomes.org/）、人群基因频率数据库（gnomAD）中未见正常人携带或携带频率小于5%的变异。通过人类基因致病性突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、Clinvar数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）及PubMed数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）查询是否有相关论文报道，已报道的相关致病变异确定为致病性变异。在线软件SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2 （http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster （https://www.mutationtaster.org/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/index.php）对点突变蛋白功能进行预测；在线软件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/）对多物种蛋白质氨基酸序列进行比对，Weblogo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）绘制序列标识图，Mutation Taster预测软件中的Phylop值评估突变位点的保守性；采用Swiss-PdbViewer软件分析变异位点氨基酸序列对SPATA7蛋白结构造成的影响。
2 结果
先证者，男，17岁。双眼视力渐进性下降2年，无明显夜盲症状。双眼BCVA均为0.4。双眼眼底可见视网膜血管变细，黄斑区营养不良样改变，周边视网膜颜色灰暗，未见明显色素沉着（图1A）。眼底AF检查，双眼鼻下象限对称性弱AF，包绕黄斑区，黄斑中心凹呈“花瓣状”强AF，其余象限未见明显异常AF（图1B）。视野检查，与变性区对应的颞上方视野缺失（图1C）。SD-OCT检查，双眼中心凹以外变性区光感受器层消失，中心凹区域外层视网膜结构紊乱；右眼黄斑颞侧视网膜光感受器层结构存在（图1D）。FFA检查，双眼视网膜动脉细，视盘周围、鼻下方视网膜色素上皮（RPE）萎缩，可见明显透见荧光，颞侧及上方视网膜远端未见明显透见荧光，黄斑中心凹被强荧光包绕（图2A，2B）。ICGA检查，双眼下方RPE及脉络膜萎缩，中晚期明显弱荧光（图2C，2D）。ERG检查，双眼暗适应波幅降低、明适应呈熄灭状态（图3）。其父母眼部表型正常。
图1
象限性RP患者右眼彩色眼底、AF、视野、SD-OCT像。1A示彩色眼底像，黄斑区营养不良样改变，周边视网膜颜色灰暗，无明显色素沉着；1B示眼底AF像，鼻下象限视网膜弱AF，黄斑中心凹强AF，黄斑和视盘周围弱AF区域与鼻下方视网膜之间存在分界（白箭）；1C示视野检查像，颞上方视野缺损；1D示SD-OCT像，黄斑区光感受器层缺失伴中心凹下方外层视网膜结构紊乱，黄斑颞侧可见光感受器层结构存在（白箭）。RP：视网膜色素变性；AF：自身荧光；SD-OCT：频域光相干断层扫描
图2
象限性RP患者FFA、ICGA像。2A、2B分别示右眼、左眼FFA拼图像，双眼视网膜动脉细，视盘周围及鼻下方视网膜RPE萎缩，可见明显透见荧光，颞侧及上方离病灶较远处的视网膜无明显透见荧光，黄斑中心凹周围被强荧光包绕。2C、2D分别示右眼ICGA中期、晚期像。双眼下方RPE及脉络膜萎缩，呈弱荧光。RP：视网膜色素变性；RPE：视网膜色素上皮；FFA：荧光素眼底血管造影；ICGA：吲哚青绿血管造影
图3
象限性RP患者ERG检查结果。3A～3C分别为右眼、左眼暗适应ERG，双眼0.01、3.0 ERG振幅降低，3.0 ERG振荡电位波形呈熄灭状态；3D、3E分别示右眼、左眼明适应ERG，双眼3.0 ERG、3.0闪光ERG波形呈熄灭状态。RP：视网膜色素变性；ERG：视网膜电图
患者全外显子序列平均测序深度为120×，99.09%的目标区域覆率＞20×，99.08%的目标区域覆率＞30×。先证者SPATA7基因第10号外显子存在一错义突变c.1112T>C（p.Ile371Thr），导致编码的SPATA7蛋白第371号氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸；其母亲携带c.1112T>C杂合突变（图4）。此变异在gnomAD中最小等位基因频率为0.000 6，ESP数据库、千人基因组计划数据库、ExAC数据库中正常对照人群中未发现此变异，Clinvar数据库报道为意义不明确突变，PubMed数据库报道为可能致病突变[11]，根据ACMG指南该变异为意义不明确变异；同源染色体存在一CNV，导致SPATA7基因第10号外显子缺失，根据ACMG指南，该变异为可能致病变异。qPCR验证结果显示，先证者CNV来源于父亲，其父亲为杂合缺失（图5）。父母均无临床表型，符合家系遗传共分离。
图4
象限性RP家系先证者及父母基因测序图。4A示先证者，SPATA7基因第10号外显子的c.1112T>C错义突变（红箭）；4B示先证者母亲，c.1112T>C杂合突变（红箭）；4C示先证者父亲，该位点不存在突变（红箭）。RP：视网膜色素变性
图5
象限性RP家系先证者及父母拷贝数变异验证结果。5A～5C分别示先证者及其父母，先证者目标区域拷贝数与其父亲一致，为杂合缺失，母亲拷贝数正常。图中“对照”为正常人标准样本。RP：视网膜色素变性
生物信息学分析结果，SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、PROVEAN预测软件对错义突变造成的氨基酸改变预测分别为有害、可能有害、致病、有害。蛋白序列同源性分析结果显示，SPATA7基因p.Ile371Thr突变所对应的第371号氨基酸位点在多个物种中均高度保守（图6A），该变异位点及周围氨基酸序列均为高度保守（图6B），在线软件预测结果Phylop值为3.203，提示该变异位点所在区域在生物功能中可能发挥重要作用。Swiss-PdbViewer分析结果显示，p.Ile371Thr与其附近氨基酸组成α螺旋结构（图6C），第371位氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸后，其羟基与第368位氨基酸（亮氨酸）形成一个额外氢键（图6D～6E），提示对该区域结构及功能可能产生影响。
图6
SPATA7基因p.Ile371Thr变异位点的生物信息学分析。6A示SPATA7蛋白序列在多个物种中的保守性分析图，变异位点所对应的第371号氨基酸位点在人（Human）、羊（Sheep）、狒狒（Baboon）、马（Horse）、大象（Elephant）、牛（Bovin）、小鼠（Mouse）、豚鼠（Guineapig）中均高度保守（黑框内）。6B示变异位点附近氨基酸序列标识图，图中字母越大，对应氨基酸越保守。6C～6E为变异位点附近蛋白二级结构预测图。6C示变异位点（黄色）与周围氨基酸序列组成α螺旋结构；6D、6E分别示6C图方框中野生型与突变型氨基酸序列，第371位氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸后，其羟基与第368位氨基酸（亮氨酸）形成一个额外氢键
3 讨论
本研究中先证者无明显夜盲，视网膜未见明显色素沉着，但有研究表明无色素性RP可能是原发性RP的早期表现[12]，因此先证者视网膜色素沉着可能随病情进展而出现。此类RP早期临床极易漏诊或误诊，应常规行眼底AF、电生理、基因测序等检查。本例患者眼底AF可见鼻下象限视网膜弱AF；对应颞上方视野缺失；RPE萎缩以视盘周围及鼻下方视网膜最为严重，而颞侧及上方离病灶较远处的视网膜相对正常；ICGA示下方脉络膜萎缩；ERG视锥、视杆系统反应均降低；且黄斑SD-OCT可见变性区光感受器层消失，而颞侧非变性区光感受器结构存在。以上结果说明患者视网膜变性以鼻下象限为主，符合sector RP诊断。作为一种非典型RP，sector RP有更轻的临床表型和更好的预后，最典型特征是视网膜变性主要局限于1～2个象限，且主要以下方视网膜为主，这可能与日常光照来源于头顶导致下方视网膜暴露于更多光刺激有关[13-14]。光暴露可引起自由基介导的细胞凋亡[13-16]，在视紫红质（RHO）基因变异所致RP动物模型中，光剥夺可减缓视网膜变性速度[17]，进一步说明光暴露对光感受器的损伤。这提示因此RP患者应尽量减少暴露于强光中。
此外，本研究中先证者存在视野缺损、椭圆体带缺失、ERG异常且ICGA晚期视网膜下方呈片状弱荧光阴影区域，与急性区域性隐匿性外层视网膜病变（AZOOR）特征较为相似，需与之鉴别。AZOOR是一种视网膜外层功能障碍性病变，好发于年轻女性，多急性起病，多数患者为单眼发病，且超过90%的AZOOR患者FFA无明显异常[18]。
本研究采用二代测序、Sanger测序及qPCR技术，对先证者相关基因及其突变位点进行鉴定，结果显示，患者SPATA7基因的第10号外显子错义突变c.1112T>C（p.Ile371Thr）和同源染色体第10号外显子缺失。SPATA7基因在物种进化中具有高度保守性，编码一种纤毛蛋白，主要表达于光感受器的连接纤毛处，可与另一种纤毛蛋白RPGRIP1的N端区域相互作用形成复合物，对RHO和其他纤毛蛋白起到引导定位作用。此外，光感受器连接纤毛处的纤毛蛋白众多，如RPGR、USH2A、CEP290、NPHP4等，它们可形成纤毛蛋白复合体，对光感受器内外节之间的物质运输起着十分重要的作用，任一基因的缺失均有可能引起视网膜病变。研究表明，敲除SPATA7基因可导致其他纤毛蛋白错误分布于连接纤毛的近段，并可导致RHO无法被运送至光感受器外节，表现为光感受器的进行性退化，外节无序并缩短，而其他视网膜神经元及RPE层无影响[19-21]。既往有报道SPATA7基因突变与LCA和青少年性RP有关[8, 22]，目前报道的SPATA7基因突变多数为无义突变或移码突变[23]，错义突变较少。本例先证者SPATA7基因错义突变和CNV均位于第10号外显子，蛋白质变异靠近C末端，而位于SPATA7蛋白C末端的突变可能会导致更轻微的临床表型[8]。但有学者报道德国一血缘家庭兄妹二人均为SPATA7基因c.1112T>C纯和错义突变，但两人临床表型差异大，哥哥表现为严重RP，而妹妹仅表现为较轻微的CRD[9]。本研究中先证者也与上述文献中患者的临床表型不同。研究结果的多样性说明SPATA7基因突变所致临床表型的异质性，即使携带相同基因型，临床表现也不尽相同。
目前已发现与sector RP相关的致病基因11个，包括常染色体显性遗传RHO[3, 24-25]、 IMPDH1[6]、RP1[6]；常染色体隐性遗传USH1C[26]、MYO7A[6]、CDH23[27]、EYS[6, 28]、SAG[29-30]、RDH5[31]；X染色体连锁遗传PRPS1[6]、RPGR [24, 32]。3种遗传模式患者的平均发病年龄分别为38.5、30.5、39.0岁[6]。本研究中先证者发病年龄15岁，远小于上述文献报道的发病年龄。此外，先证者近2年视力逐渐下降，双眼BCVA均为0.4，低于sector RP患者的平均视力[6]，且眼底照相显示黄斑区营养不良样改变，眼底AF可见黄斑中心凹及视盘周围弱AF区域与鼻下方视网膜之间存在明显分界线，此分界线也成为ICGA晚期低灌注区的分界线。其原因可能与2处视网膜病变进展不同有关，分界线上方病灶存在一定程度RPE萎缩但脉络膜无明显萎缩；分界线下方则为RPE-Bruch膜-脉络膜均萎缩。黄斑中心凹呈强AF，说明中心凹区域为高代谢状态，意味此区域光感受器细胞可能正在逐渐死亡，导致自体荧光物质（脂褐素）的累积，而ERG检查示明适应呈熄灭状态进一步证明视锥细胞数量严重减少，我们认为这可能是疾病动态进展的表现。Georgiou等[6]对1例累及黄斑的sector RP患者进行了长达13.5年的随访，发现其病情进展及视力损害均更加严重。进一步说明当sector RP累及黄斑后，其临床表现更重，病情进展也更快。
尽管近年来药物、视网膜假体及干细胞治疗等方法快速发展，但目前对于sector RP尚无有效治疗方法。随着测序技术发展和基因治疗的进步，针对特定基因突变的编辑技术逐渐受到重视。在SPATA7基因敲除小鼠中行腺相关病毒8载体介导的基因替代治疗显示，与对照组比较，治疗组小鼠光感受器存活率增加，ERG反应改善，并可挽救RHO的异常定位[33]，证明基因治疗在SPATA7基因突变所致RP中具有治疗前景。
本研究发现SPATA7基因可能与常染色体隐性sector RP相关，扩大了sector RP的基因突变频谱，增加了SPATA7基因突变的临床表型异质性，同时还观察到sector RP可累及黄斑，造成黄斑营养不良，导致更严重的临床表型，为sector RP的后续研究提供了思路。本课题组将继续对此家系进行长期跟踪随访，观察病情进展，同时收集其他非典型RP家系资料，以进一步探索此类病变的形成机制。
视网膜色素变性（RP）是一组具有高度遗传异质性的神经退行性疾病，以夜盲、视野缺损及视网膜变性为主要特征[1]。其眼底常表现为骨细胞样色素沉着、视网膜血管变细及视盘颜色蜡黄等。象限性RP（sector RP）是一种罕见的非典型性RP，以常染色体显性遗传居多，双眼视网膜变性对称，主要局限于1～2个象限，以下方（尤其鼻下方）视网膜为主，对应上方视野缺损[2-3]；病变保持静止或进展缓慢，常可保存较好的中心视力[4]，有文献报道82%的sector RP患者视力≥0.5[5]。基因突变是sector RP发病的主要危险因素，目前已证实与sector RP相关的致病基因11个[6]，遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X染色体连锁遗传。目前针对sector RP的研究较少且不够深入，其致病机制仍不清楚。精母细胞相关蛋白7（SPATA7，OMIM: 609868）基因，位于染色体14q31.3，包含12个外显子，编码599个氨基酸的蛋白质，在进化中高度保守，依据3号外显子的可变剪接编码2种蛋白亚型，其中包含3号外显子编码的亚型主要表达于视网膜和脑[7]，对光感受器内外节的物质运输起着重要作用。其突变与常染色体隐性Leber先天性黑矇（LCA）和青少年性RP有关[8]；此外，还可造成锥杆细胞营养不良（CRD）[9]。本研究对由SPATA7基因所致sector RP的1个家系的基因型和临床表型进行分析，以期为进一步对特定基因的潜在致病机制及治疗方案的研究提供新线索。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，经武汉大学人民医院伦理委员会审批（批准号：WDRY2019-K032）；受检者及监护人均获知情并签署书面知情同意书。
2021年4月于武汉大学人民医院眼科就诊的1个sector RP家系中先证者及其父母纳入研究。详细询问患者病史和家族史，并行最佳矫正视力（BCVA）、眼底彩色照相、自身荧光（AF）、视野、频域光相干断层扫描（SD-OCT）、视网膜电图（ERG）、荧光素眼底血管造影（FFA）、吲哚青绿血管造影（ICGA）检查。
采集先证者及其父母外周静脉血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德国Qiagen公司QiAamp® Blood Mini Kit试剂盒按照标准操作流程提取全基因组DNA，应用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000分光光度计对基因组DNA质量和数量进行评估。采用美国NEB公司NEBNext dsDNA Fragmentase打碎DNA序列，美国IDT公司xGen® Exome Research Panel v1.0试剂盒对DNA目标区域进行捕获，建立DNA文库；采用美国Illumina公司Illumina NovaSeq6000高通量测序仪对DNA样本进行测序。测序数据处理包括序列生成、序列比对（GRCh37）、变异识别（包括单核苷酸突变、删除和插入变异）、变异筛选、变异注释、变异优化，所有确定变异的致病性预测根据美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）指南[10]进行评估。
采用拷贝数变异（CNV）kit试剂盒检测CNV，CNV参考序列由内部样本建立。CNV识别中，采用循环二元分割算法对CNV变异进行分割，阈值参数设置为“－1.6、－0.8、0.5、1.0”。拷贝数结果以log2拷贝率的计算值呈现；B等位基因频率由Samtools的mpileup计算得出，利用AnnotSV及其注释数据库对检测到的CNV进行注释。
对SPATA7错义突变采用Sanger测序并进行家系共分离验证。Sanger测序中，应用Primer 5.0引物设计软件设计引物，以基因组DNA为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增含有变异的外显子片段，对PCR扩增的目的DNA片段进行纯化并测序，Chromas软件分析测序结果。CNV采用实时定量PCR（qPCR）进行验证，美国Thermo Fisher Scientific公司Applied Biosystems™ 7500 qPCR系统进行qPCR反应。
致病变异位点筛选原则：外显子测序项目（ESP）数据库（https://esp.gs.washington.edu/drupal/）、筛选ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）、千人基因组计划数据库（http://www.1000genomes.org/）、人群基因频率数据库（gnomAD）中未见正常人携带或携带频率小于5%的变异。通过人类基因致病性突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、Clinvar数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）及PubMed数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）查询是否有相关论文报道，已报道的相关致病变异确定为致病性变异。在线软件SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2 （http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster （https://www.mutationtaster.org/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/index.php）对点突变蛋白功能进行预测；在线软件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/）对多物种蛋白质氨基酸序列进行比对，Weblogo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）绘制序列标识图，Mutation Taster预测软件中的Phylop值评估突变位点的保守性；采用Swiss-PdbViewer软件分析变异位点氨基酸序列对SPATA7蛋白结构造成的影响。
2 结果
先证者，男，17岁。双眼视力渐进性下降2年，无明显夜盲症状。双眼BCVA均为0.4。双眼眼底可见视网膜血管变细，黄斑区营养不良样改变，周边视网膜颜色灰暗，未见明显色素沉着（图1A）。眼底AF检查，双眼鼻下象限对称性弱AF，包绕黄斑区，黄斑中心凹呈“花瓣状”强AF，其余象限未见明显异常AF（图1B）。视野检查，与变性区对应的颞上方视野缺失（图1C）。SD-OCT检查，双眼中心凹以外变性区光感受器层消失，中心凹区域外层视网膜结构紊乱；右眼黄斑颞侧视网膜光感受器层结构存在（图1D）。FFA检查，双眼视网膜动脉细，视盘周围、鼻下方视网膜色素上皮（RPE）萎缩，可见明显透见荧光，颞侧及上方视网膜远端未见明显透见荧光，黄斑中心凹被强荧光包绕（图2A，2B）。ICGA检查，双眼下方RPE及脉络膜萎缩，中晚期明显弱荧光（图2C，2D）。ERG检查，双眼暗适应波幅降低、明适应呈熄灭状态（图3）。其父母眼部表型正常。
图1
象限性RP患者右眼彩色眼底、AF、视野、SD-OCT像。1A示彩色眼底像，黄斑区营养不良样改变，周边视网膜颜色灰暗，无明显色素沉着；1B示眼底AF像，鼻下象限视网膜弱AF，黄斑中心凹强AF，黄斑和视盘周围弱AF区域与鼻下方视网膜之间存在分界（白箭）；1C示视野检查像，颞上方视野缺损；1D示SD-OCT像，黄斑区光感受器层缺失伴中心凹下方外层视网膜结构紊乱，黄斑颞侧可见光感受器层结构存在（白箭）。RP：视网膜色素变性；AF：自身荧光；SD-OCT：频域光相干断层扫描
图2
象限性RP患者FFA、ICGA像。2A、2B分别示右眼、左眼FFA拼图像，双眼视网膜动脉细，视盘周围及鼻下方视网膜RPE萎缩，可见明显透见荧光，颞侧及上方离病灶较远处的视网膜无明显透见荧光，黄斑中心凹周围被强荧光包绕。2C、2D分别示右眼ICGA中期、晚期像。双眼下方RPE及脉络膜萎缩，呈弱荧光。RP：视网膜色素变性；RPE：视网膜色素上皮；FFA：荧光素眼底血管造影；ICGA：吲哚青绿血管造影
图3
象限性RP患者ERG检查结果。3A～3C分别为右眼、左眼暗适应ERG，双眼0.01、3.0 ERG振幅降低，3.0 ERG振荡电位波形呈熄灭状态；3D、3E分别示右眼、左眼明适应ERG，双眼3.0 ERG、3.0闪光ERG波形呈熄灭状态。RP：视网膜色素变性；ERG：视网膜电图
患者全外显子序列平均测序深度为120×，99.09%的目标区域覆率＞20×，99.08%的目标区域覆率＞30×。先证者SPATA7基因第10号外显子存在一错义突变c.1112T>C（p.Ile371Thr），导致编码的SPATA7蛋白第371号氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸；其母亲携带c.1112T>C杂合突变（图4）。此变异在gnomAD中最小等位基因频率为0.000 6，ESP数据库、千人基因组计划数据库、ExAC数据库中正常对照人群中未发现此变异，Clinvar数据库报道为意义不明确突变，PubMed数据库报道为可能致病突变[11]，根据ACMG指南该变异为意义不明确变异；同源染色体存在一CNV，导致SPATA7基因第10号外显子缺失，根据ACMG指南，该变异为可能致病变异。qPCR验证结果显示，先证者CNV来源于父亲，其父亲为杂合缺失（图5）。父母均无临床表型，符合家系遗传共分离。
图4
象限性RP家系先证者及父母基因测序图。4A示先证者，SPATA7基因第10号外显子的c.1112T>C错义突变（红箭）；4B示先证者母亲，c.1112T>C杂合突变（红箭）；4C示先证者父亲，该位点不存在突变（红箭）。RP：视网膜色素变性
图5
象限性RP家系先证者及父母拷贝数变异验证结果。5A～5C分别示先证者及其父母，先证者目标区域拷贝数与其父亲一致，为杂合缺失，母亲拷贝数正常。图中“对照”为正常人标准样本。RP：视网膜色素变性
生物信息学分析结果，SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、PROVEAN预测软件对错义突变造成的氨基酸改变预测分别为有害、可能有害、致病、有害。蛋白序列同源性分析结果显示，SPATA7基因p.Ile371Thr突变所对应的第371号氨基酸位点在多个物种中均高度保守（图6A），该变异位点及周围氨基酸序列均为高度保守（图6B），在线软件预测结果Phylop值为3.203，提示该变异位点所在区域在生物功能中可能发挥重要作用。Swiss-PdbViewer分析结果显示，p.Ile371Thr与其附近氨基酸组成α螺旋结构（图6C），第371位氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸后，其羟基与第368位氨基酸（亮氨酸）形成一个额外氢键（图6D～6E），提示对该区域结构及功能可能产生影响。
图6
SPATA7基因p.Ile371Thr变异位点的生物信息学分析。6A示SPATA7蛋白序列在多个物种中的保守性分析图，变异位点所对应的第371号氨基酸位点在人（Human）、羊（Sheep）、狒狒（Baboon）、马（Horse）、大象（Elephant）、牛（Bovin）、小鼠（Mouse）、豚鼠（Guineapig）中均高度保守（黑框内）。6B示变异位点附近氨基酸序列标识图，图中字母越大，对应氨基酸越保守。6C～6E为变异位点附近蛋白二级结构预测图。6C示变异位点（黄色）与周围氨基酸序列组成α螺旋结构；6D、6E分别示6C图方框中野生型与突变型氨基酸序列，第371位氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸后，其羟基与第368位氨基酸（亮氨酸）形成一个额外氢键
3 讨论
本研究中先证者无明显夜盲，视网膜未见明显色素沉着，但有研究表明无色素性RP可能是原发性RP的早期表现[12]，因此先证者视网膜色素沉着可能随病情进展而出现。此类RP早期临床极易漏诊或误诊，应常规行眼底AF、电生理、基因测序等检查。本例患者眼底AF可见鼻下象限视网膜弱AF；对应颞上方视野缺失；RPE萎缩以视盘周围及鼻下方视网膜最为严重，而颞侧及上方离病灶较远处的视网膜相对正常；ICGA示下方脉络膜萎缩；ERG视锥、视杆系统反应均降低；且黄斑SD-OCT可见变性区光感受器层消失，而颞侧非变性区光感受器结构存在。以上结果说明患者视网膜变性以鼻下象限为主，符合sector RP诊断。作为一种非典型RP，sector RP有更轻的临床表型和更好的预后，最典型特征是视网膜变性主要局限于1～2个象限，且主要以下方视网膜为主，这可能与日常光照来源于头顶导致下方视网膜暴露于更多光刺激有关[13-14]。光暴露可引起自由基介导的细胞凋亡[13-16]，在视紫红质（RHO）基因变异所致RP动物模型中，光剥夺可减缓视网膜变性速度[17]，进一步说明光暴露对光感受器的损伤。这提示因此RP患者应尽量减少暴露于强光中。
此外，本研究中先证者存在视野缺损、椭圆体带缺失、ERG异常且ICGA晚期视网膜下方呈片状弱荧光阴影区域，与急性区域性隐匿性外层视网膜病变（AZOOR）特征较为相似，需与之鉴别。AZOOR是一种视网膜外层功能障碍性病变，好发于年轻女性，多急性起病，多数患者为单眼发病，且超过90%的AZOOR患者FFA无明显异常[18]。
本研究采用二代测序、Sanger测序及qPCR技术，对先证者相关基因及其突变位点进行鉴定，结果显示，患者SPATA7基因的第10号外显子错义突变c.1112T>C（p.Ile371Thr）和同源染色体第10号外显子缺失。SPATA7基因在物种进化中具有高度保守性，编码一种纤毛蛋白，主要表达于光感受器的连接纤毛处，可与另一种纤毛蛋白RPGRIP1的N端区域相互作用形成复合物，对RHO和其他纤毛蛋白起到引导定位作用。此外，光感受器连接纤毛处的纤毛蛋白众多，如RPGR、USH2A、CEP290、NPHP4等，它们可形成纤毛蛋白复合体，对光感受器内外节之间的物质运输起着十分重要的作用，任一基因的缺失均有可能引起视网膜病变。研究表明，敲除SPATA7基因可导致其他纤毛蛋白错误分布于连接纤毛的近段，并可导致RHO无法被运送至光感受器外节，表现为光感受器的进行性退化，外节无序并缩短，而其他视网膜神经元及RPE层无影响[19-21]。既往有报道SPATA7基因突变与LCA和青少年性RP有关[8, 22]，目前报道的SPATA7基因突变多数为无义突变或移码突变[23]，错义突变较少。本例先证者SPATA7基因错义突变和CNV均位于第10号外显子，蛋白质变异靠近C末端，而位于SPATA7蛋白C末端的突变可能会导致更轻微的临床表型[8]。但有学者报道德国一血缘家庭兄妹二人均为SPATA7基因c.1112T>C纯和错义突变，但两人临床表型差异大，哥哥表现为严重RP，而妹妹仅表现为较轻微的CRD[9]。本研究中先证者也与上述文献中患者的临床表型不同。研究结果的多样性说明SPATA7基因突变所致临床表型的异质性，即使携带相同基因型，临床表现也不尽相同。
目前已发现与sector RP相关的致病基因11个，包括常染色体显性遗传RHO[3, 24-25]、 IMPDH1[6]、RP1[6]；常染色体隐性遗传USH1C[26]、MYO7A[6]、CDH23[27]、EYS[6, 28]、SAG[29-30]、RDH5[31]；X染色体连锁遗传PRPS1[6]、RPGR [24, 32]。3种遗传模式患者的平均发病年龄分别为38.5、30.5、39.0岁[6]。本研究中先证者发病年龄15岁，远小于上述文献报道的发病年龄。此外，先证者近2年视力逐渐下降，双眼BCVA均为0.4，低于sector RP患者的平均视力[6]，且眼底照相显示黄斑区营养不良样改变，眼底AF可见黄斑中心凹及视盘周围弱AF区域与鼻下方视网膜之间存在明显分界线，此分界线也成为ICGA晚期低灌注区的分界线。其原因可能与2处视网膜病变进展不同有关，分界线上方病灶存在一定程度RPE萎缩但脉络膜无明显萎缩；分界线下方则为RPE-Bruch膜-脉络膜均萎缩。黄斑中心凹呈强AF，说明中心凹区域为高代谢状态，意味此区域光感受器细胞可能正在逐渐死亡，导致自体荧光物质（脂褐素）的累积，而ERG检查示明适应呈熄灭状态进一步证明视锥细胞数量严重减少，我们认为这可能是疾病动态进展的表现。Georgiou等[6]对1例累及黄斑的sector RP患者进行了长达13.5年的随访，发现其病情进展及视力损害均更加严重。进一步说明当sector RP累及黄斑后，其临床表现更重，病情进展也更快。
尽管近年来药物、视网膜假体及干细胞治疗等方法快速发展，但目前对于sector RP尚无有效治疗方法。随着测序技术发展和基因治疗的进步，针对特定基因突变的编辑技术逐渐受到重视。在SPATA7基因敲除小鼠中行腺相关病毒8载体介导的基因替代治疗显示，与对照组比较，治疗组小鼠光感受器存活率增加，ERG反应改善，并可挽救RHO的异常定位[33]，证明基因治疗在SPATA7基因突变所致RP中具有治疗前景。
本研究发现SPATA7基因可能与常染色体隐性sector RP相关，扩大了sector RP的基因突变频谱，增加了SPATA7基因突变的临床表型异质性，同时还观察到sector RP可累及黄斑，造成黄斑营养不良，导致更严重的临床表型，为sector RP的后续研究提供了思路。本课题组将继续对此家系进行长期跟踪随访，观察病情进展，同时收集其他非典型RP家系资料，以进一步探索此类病变的形成机制。
