微血管功能障碍是糖尿病视网膜病变（DR）的关键病理机制。近年来研究发现，糖尿病患者普遍存在“代谢记忆”现象，即使其血糖控制良好，也无法避免糖尿病微血管病变。因此，从基因角度来探索DR的发病机制非常必要。miR-126是血管内皮细胞唯一特异性表达的microRNA，与新生血管的形成关系密切，可影响DR微血管的稳定性及内皮细胞的萌芽和迁移，且其基因水平与血管内皮细胞生长因子的表达呈显著负相关。细胞内和循环中的miR-126在DR微血管稳态调节、早期诊疗和病程监测等方面的潜在价值受到了极大的关注，但这一领域的研究报道多以假说为驱动，仍有一定局限性。相信随着基因组学的快速发展，miRNA谱及其在眼发育和眼部疾病中的分子机制将会逐渐清晰，未来可能会在个别难治性视网膜疾病的干预中率先获得突破，建立一种新型的miRNA诊疗手段。
引用本文： 王瑞, 罗向霞, 胡婷婷, 张钰洁. miR-126在糖尿病视网膜病变发病机制及诊疗应用中的作用研究进展. 中华眼底病杂志, 2021, 37(11): 906-910. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201103-00531 复制
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miR-126是最早由Lagos-Quintana等[1]在小鼠心脏和小脑中发现的一种长约20～25 nt的非编码RNA，位于表皮生长因子样结构域7基因7号内含子内，其核酸序列为5'-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3'。它的合成过程与信使RNA类似，涉及位于细胞核和细胞质中的多种RNA酶[2]。miR-126通常存在于细胞内环境中，能够识别多个同源靶mRNA的3'非编码区，并与之不同程度结合，于转录水平负向调控这些目的基因，使其降解或抑制翻译过程，但是其本身不编码任何蛋白质[3-4]。它也可在细胞外环境中存在，如循环miR-126，具有高度的保守性、时间特异性和组织特异性[5]，这种非编码RNA属于表观遗传学范畴。目前发现，miR-126、miR-122、miR-200b、miR-146、miR-150、miR-31、let-7等与糖尿病视网膜病变（DR）新生血管形成均有一定联系[6-8]，而miR-126是血管内皮细胞（VECs）唯一特异性表达的microRNA。VECs分泌miR-126后，进入循环系统，参加了多种病理生理的调节过程，包括正常血管和肿瘤组织血管的增生、分化、凋亡、代谢及免疫作用等[9-11]。由此可见，miR-126属于调控血管生成的靶基因miRNA，可调节VECs的功能和新生血管的完整性。miR-126与新生血管的形成关系密切，可影响DR微血管的稳定性及内皮细胞的萌芽和迁移，且其基因水平与血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达呈显著负相关。这提示miR-126对DR的诊治可能具有重要价值。现就miR-126在对DR的调控机制及其在DR诊疗中的应用价值研究现状及进展作一综述。
1 miR-126对DR的调控机制
DR的关键病理机制是微血管功能障碍[11]，而近年来发现糖尿病患者普遍存在“代谢记忆”现象，即使血糖控制良好的糖尿病患者，也无法避免糖尿病微血管病变[12-13]。因此，从基因角度来探索DR是非常必要的，这与miR-126调控微血管方面的机制相契合。miR-126在DR、老年性黄斑变性、视网膜母细胞瘤和角膜新生血管与移植等眼科疾病的发生和发展中均发挥一定作用，其中DR与之关系密切[6, 9, 14]。但是，miR-126对DR的微血管调控机制非常复杂，主要表现为微血管异常和炎症反应，其中涉及多种信号分子和通路[15]。
1.1 调控微血管稳态
在高糖缺氧环境中，miR-126通过多种途径调节视网膜VEGF、缺氧诱导因子-1（HIF-1）和胰岛素样生长因子等，进而促进VECs完整性，同时抑制增生的VECs迁移所导致的新生血管萌芽；若异常新生血管已经出芽，miR-126可促使其稳定发育，减少渗漏及出血[16-18]。研究表明，miR-126主要通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路磷酸化的负调控作用来调节VEGF、血管生成因子和碱性成纤维细胞生长因子等主要血管生长因子的表达水平，进而影响血管细胞迁移、骨架重组、毛细管网稳定性和细胞生存环境稳态，最终减缓视网膜新生血管的发生[19-20]。在小鼠DR模型和人脐静脉血管内皮细胞模型中，miR-126与VEGF的表达存在时间依赖的相关性，随着DR不断进展，miR-126和VEGF通过相互影响来调控DR引发的视网膜新生血管[21]。目前来看，这与阻断VEGF/PI3K/AKT信号通路中的VEGFA和PIK3受体2有关，而miR-126表达的正常化，可能通过阻滞内皮细胞周期和抑制VEGF及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，进而减少缺氧诱导的新生血管[22]。另外，miR-126a/b基因还能靶向调节其关键的下游信号因子p21-激活激酶1，进而促进MMP-9对上述途径的协同作用，抑制VECs的迁移，共同调控血管形成[23-25]。此外，VECs中的C-RAF原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶（Raf1）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路也受到miR-126的调控，当miR-126表达明显下调时，激活p38和ERK信号分子，同样也能抑制DR的新生血管萌芽，缓解DR微血管损害[26]。而在视网膜周细胞中，高糖/低氧条件下，骨髓间充质干细胞分泌的细胞外小泡能够下调周细胞中miR-126的表达，同时VEGF/HIF-1α信号通路被激活，导致DR微血管稳态失衡[27]。高糖缺氧环境下诱导的增生型DR（PDR）小鼠模型miR-126表达降低，而玻璃体腔注射miR-126可明显减少小鼠视网膜新生血管的生成[28]。这说明miR-126基因缺陷后可能造成血管完整性受损，通透性增加。Chen等[29]和Zhao等[30]的研究也支持miR-126稳定微血管的说法。通过miR-126基因的后天干预与该基因先天性缺失引起的血管病理改变是相近的，miR-126通过稳定微血管和保证内皮细胞完整性来干预DR的发生和发展[31]。总的来说，miR-126在DR的发生发展中能稳定微血管生长，同时又可以通过不同信号通路结合多个靶标[18, 32]，并且可能起到正向或负向调节作用，其具体的生物学效应取决于相应的途径[25]。
1.2 抑制炎症反应
炎症反应伴随着DR全过程，与视网膜内促炎性细胞因子和趋化因子的表达、炎性细胞浸润、新生血管形成、血管通透性的增加、视网膜水肿和组织破坏密切相关[33]。DR患者在高血糖环境下产生大量细胞因子，激活内皮细胞上调黏附分子，如血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的表达，促使白细胞向炎症部位的运输，介导白细胞与内皮细胞的黏附。VECs释放的miR-126可抑制VCAM-1表达，减轻炎症反应，而当miR-126的寡核苷酸转染下调时，VECs会上调肿瘤坏死因子α的表达，进而刺激VCAM-1表达[34]。高血糖显著增加了糖尿病大鼠或人类视网膜内皮细胞（HRECs）的炎症反应，其中白细胞介素（IL）-1β、半胱天冬酶（Caspase）-1和IL-18的表达水平明显升高，这时由于miR-126在间充质干细胞来源的外切体中的高表达，下调高迁移率族蛋白1信号通路，进而减轻高血糖诱导的视网膜炎症[35]。Chen等[36]利用HRECs实验证明了IL-17A是miR-126的靶标，且被该基因负向调节。因此，miR-126可以调节多种黏附分子和炎症因子的表达，对DR血管炎症进行多位点负调控。
2 miR-126对DR的诊断和治疗前景
当前研究发现，在DR患者的血浆、尿液和泪液中都可以检测出miR-126，它以非常稳定的两种形式存在：被包裹在微粒中形成外泌体，或被组装成复合物，通过VECs、周细胞等分泌释放出胞体后进入循环，因此可以免受内源性核糖核酸酶的溶解[37-39]。与无明显并发症的2型糖尿病患者相比，有并发症的2型糖尿病患者，尤其是伴有大血管并发症和DR者血清miR-126的表达水平明显降低[40]。同样，在一大批1型糖尿病患者中，miR-126水平与糖尿病的微血管并发症，特别是增生性视网膜病变相关[41]。研究表明，DR患者血浆miR-126的相对含量随DR严重程度加重而减少[42]。Qin等[43]研究表明，当血清miR-126含量≤5.02时，发生PDR的可能性增大。Liu等[44]一项临床试验表明，PDR的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期患者血浆miR-126的表达水平均显著高于特发性黄斑裂孔患者，且其表达水平随着PDR严重程度加重而增加。其中，VEGF表达水平与miR-126表达水平呈负相关。另外，Zampetaki等[45]对1型糖尿病患者（包括有/无并发症患者）的混合血清样本进行了miRNA图谱分析，在25个差异表达的血清miRNA中同样验证了miR-126的诊断价值。因此，循环miR-126图谱具有疾病特异性，一定程度上代表了疾病的分子特征[46]。
近年来，DR的治疗手段越来越丰富，除了传统的激光光凝、玻璃体切割手术外，抗VEGF药物等新型治疗手段也得到了眼科医生的认可，但这些治疗方案主要集中于PDR，且都是侵入性的，存在眼内炎、眼底再次出血等严重不良反应，因此具有一定的局限性[47]。在新生血管形成过程中，miR-126对基质蛋白积累和血管通透性方面影响较大，而这些都是引起黄斑水肿而造成患者视力丧失的重要因素[14]。在糖尿病并发创面的研究中，负压创面疗法可上调创面和血浆中miR-126的表达，促进创面的毛细血管修复[10]。而在糖尿病伤口愈合的不同阶段，miRNA对DR血管修复均具有促进效应[48]。血管内皮功能障碍的关键是VECs的衰老。在衰老的血管内皮细胞中HIF-1α和miR-126表达水平均降低，而miR-126的抑制会降低HIF-1α的蛋白表达，说明miR-126/HIF-1α通路可能在其中起到正调节作用[11]。另外，萤光素酶报告系统证明了循环系统miR-126通过调节转录后循环系统组织因子的表达来影响DR脉管系统的止血平衡，进而减少血栓形成而导致的出血[49]。Wang和Yan[50]应用烟酸缓释片治疗DR大鼠，结果显示大鼠视网膜中miR-126表达增加，VEGF/VEGFR、VCAM-1/CD45表达降低，同时细胞凋亡和血视网膜屏障的破坏减少，提示miR-126通路可能参与了烟酸缓释片治疗的正面调节效应。
总体来看，非侵入性、经济有效的循环miR-126可作为DR的新型生物标志物，在早期诊断和鉴别诊断、中期监测和晚期预后评估方面具有巨大的潜在价值，尤其在目前糖尿病大流行背景下，可仅基于血尿样本对糖尿病和DR患者进行大规模筛查，实用意义较大。但是目前miR-126有效的递送系统及其特异性仍然需要深入挖掘，其诊断的稳定性和特异性还有待进一步的大数据研究。
3 小结
细胞内和循环中的miR-126在DR视网膜微血管稳态中的调节、早期诊断、进程监测和治疗等方面的潜在价值受到了极大的关注，但是在这一领域的研究仍有一定局限性。（1）多数报道是以假说为驱动的，仍需要大量的随机对照试验等高级别的临床试验证据加以说明其潜在的临床价值。（2）单一的生物标志物本身对疾病的诊断和预测的敏感性和特异性较差，联合检测几个标志物可以提高对疾病的诊断能力。（3）目前利用miR-126治疗DR还仅限于动物实验研究，而且这些研究的重复性不高。（4）现有的临床研究缺少标准的研究方案，miR-126的水平与微血管损害之间的关系缺少量化标准。（5）目前临床中尚无专门检测miR-126水平的仪器，同时受样本质量和患者本身的影响，结果缺乏可靠性[37, 51]。
但是，随着基因组学的快速发展，通过获取“分子签名”等组学方法可更好的进行生物标记物的研究，miRNA谱及其在眼发育和眼部疾病中的分子机制将会逐渐清晰，未来可能会在个别难治性视网膜疾病的干预中率先获得突破，建立一种新型的miRNA诊疗手段。
miR-126是最早由Lagos-Quintana等[1]在小鼠心脏和小脑中发现的一种长约20～25 nt的非编码RNA，位于表皮生长因子样结构域7基因7号内含子内，其核酸序列为5'-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-3'。它的合成过程与信使RNA类似，涉及位于细胞核和细胞质中的多种RNA酶[2]。miR-126通常存在于细胞内环境中，能够识别多个同源靶mRNA的3'非编码区，并与之不同程度结合，于转录水平负向调控这些目的基因，使其降解或抑制翻译过程，但是其本身不编码任何蛋白质[3-4]。它也可在细胞外环境中存在，如循环miR-126，具有高度的保守性、时间特异性和组织特异性[5]，这种非编码RNA属于表观遗传学范畴。目前发现，miR-126、miR-122、miR-200b、miR-146、miR-150、miR-31、let-7等与糖尿病视网膜病变（DR）新生血管形成均有一定联系[6-8]，而miR-126是血管内皮细胞（VECs）唯一特异性表达的microRNA。VECs分泌miR-126后，进入循环系统，参加了多种病理生理的调节过程，包括正常血管和肿瘤组织血管的增生、分化、凋亡、代谢及免疫作用等[9-11]。由此可见，miR-126属于调控血管生成的靶基因miRNA，可调节VECs的功能和新生血管的完整性。miR-126与新生血管的形成关系密切，可影响DR微血管的稳定性及内皮细胞的萌芽和迁移，且其基因水平与血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达呈显著负相关。这提示miR-126对DR的诊治可能具有重要价值。现就miR-126在对DR的调控机制及其在DR诊疗中的应用价值研究现状及进展作一综述。
1 miR-126对DR的调控机制
DR的关键病理机制是微血管功能障碍[11]，而近年来发现糖尿病患者普遍存在“代谢记忆”现象，即使血糖控制良好的糖尿病患者，也无法避免糖尿病微血管病变[12-13]。因此，从基因角度来探索DR是非常必要的，这与miR-126调控微血管方面的机制相契合。miR-126在DR、老年性黄斑变性、视网膜母细胞瘤和角膜新生血管与移植等眼科疾病的发生和发展中均发挥一定作用，其中DR与之关系密切[6, 9, 14]。但是，miR-126对DR的微血管调控机制非常复杂，主要表现为微血管异常和炎症反应，其中涉及多种信号分子和通路[15]。
1.1 调控微血管稳态
在高糖缺氧环境中，miR-126通过多种途径调节视网膜VEGF、缺氧诱导因子-1（HIF-1）和胰岛素样生长因子等，进而促进VECs完整性，同时抑制增生的VECs迁移所导致的新生血管萌芽；若异常新生血管已经出芽，miR-126可促使其稳定发育，减少渗漏及出血[16-18]。研究表明，miR-126主要通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路磷酸化的负调控作用来调节VEGF、血管生成因子和碱性成纤维细胞生长因子等主要血管生长因子的表达水平，进而影响血管细胞迁移、骨架重组、毛细管网稳定性和细胞生存环境稳态，最终减缓视网膜新生血管的发生[19-20]。在小鼠DR模型和人脐静脉血管内皮细胞模型中，miR-126与VEGF的表达存在时间依赖的相关性，随着DR不断进展，miR-126和VEGF通过相互影响来调控DR引发的视网膜新生血管[21]。目前来看，这与阻断VEGF/PI3K/AKT信号通路中的VEGFA和PIK3受体2有关，而miR-126表达的正常化，可能通过阻滞内皮细胞周期和抑制VEGF及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，进而减少缺氧诱导的新生血管[22]。另外，miR-126a/b基因还能靶向调节其关键的下游信号因子p21-激活激酶1，进而促进MMP-9对上述途径的协同作用，抑制VECs的迁移，共同调控血管形成[23-25]。此外，VECs中的C-RAF原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶（Raf1）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路也受到miR-126的调控，当miR-126表达明显下调时，激活p38和ERK信号分子，同样也能抑制DR的新生血管萌芽，缓解DR微血管损害[26]。而在视网膜周细胞中，高糖/低氧条件下，骨髓间充质干细胞分泌的细胞外小泡能够下调周细胞中miR-126的表达，同时VEGF/HIF-1α信号通路被激活，导致DR微血管稳态失衡[27]。高糖缺氧环境下诱导的增生型DR（PDR）小鼠模型miR-126表达降低，而玻璃体腔注射miR-126可明显减少小鼠视网膜新生血管的生成[28]。这说明miR-126基因缺陷后可能造成血管完整性受损，通透性增加。Chen等[29]和Zhao等[30]的研究也支持miR-126稳定微血管的说法。通过miR-126基因的后天干预与该基因先天性缺失引起的血管病理改变是相近的，miR-126通过稳定微血管和保证内皮细胞完整性来干预DR的发生和发展[31]。总的来说，miR-126在DR的发生发展中能稳定微血管生长，同时又可以通过不同信号通路结合多个靶标[18, 32]，并且可能起到正向或负向调节作用，其具体的生物学效应取决于相应的途径[25]。
1.2 抑制炎症反应
炎症反应伴随着DR全过程，与视网膜内促炎性细胞因子和趋化因子的表达、炎性细胞浸润、新生血管形成、血管通透性的增加、视网膜水肿和组织破坏密切相关[33]。DR患者在高血糖环境下产生大量细胞因子，激活内皮细胞上调黏附分子，如血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的表达，促使白细胞向炎症部位的运输，介导白细胞与内皮细胞的黏附。VECs释放的miR-126可抑制VCAM-1表达，减轻炎症反应，而当miR-126的寡核苷酸转染下调时，VECs会上调肿瘤坏死因子α的表达，进而刺激VCAM-1表达[34]。高血糖显著增加了糖尿病大鼠或人类视网膜内皮细胞（HRECs）的炎症反应，其中白细胞介素（IL）-1β、半胱天冬酶（Caspase）-1和IL-18的表达水平明显升高，这时由于miR-126在间充质干细胞来源的外切体中的高表达，下调高迁移率族蛋白1信号通路，进而减轻高血糖诱导的视网膜炎症[35]。Chen等[36]利用HRECs实验证明了IL-17A是miR-126的靶标，且被该基因负向调节。因此，miR-126可以调节多种黏附分子和炎症因子的表达，对DR血管炎症进行多位点负调控。
2 miR-126对DR的诊断和治疗前景
当前研究发现，在DR患者的血浆、尿液和泪液中都可以检测出miR-126，它以非常稳定的两种形式存在：被包裹在微粒中形成外泌体，或被组装成复合物，通过VECs、周细胞等分泌释放出胞体后进入循环，因此可以免受内源性核糖核酸酶的溶解[37-39]。与无明显并发症的2型糖尿病患者相比，有并发症的2型糖尿病患者，尤其是伴有大血管并发症和DR者血清miR-126的表达水平明显降低[40]。同样，在一大批1型糖尿病患者中，miR-126水平与糖尿病的微血管并发症，特别是增生性视网膜病变相关[41]。研究表明，DR患者血浆miR-126的相对含量随DR严重程度加重而减少[42]。Qin等[43]研究表明，当血清miR-126含量≤5.02时，发生PDR的可能性增大。Liu等[44]一项临床试验表明，PDR的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期患者血浆miR-126的表达水平均显著高于特发性黄斑裂孔患者，且其表达水平随着PDR严重程度加重而增加。其中，VEGF表达水平与miR-126表达水平呈负相关。另外，Zampetaki等[45]对1型糖尿病患者（包括有/无并发症患者）的混合血清样本进行了miRNA图谱分析，在25个差异表达的血清miRNA中同样验证了miR-126的诊断价值。因此，循环miR-126图谱具有疾病特异性，一定程度上代表了疾病的分子特征[46]。
近年来，DR的治疗手段越来越丰富，除了传统的激光光凝、玻璃体切割手术外，抗VEGF药物等新型治疗手段也得到了眼科医生的认可，但这些治疗方案主要集中于PDR，且都是侵入性的，存在眼内炎、眼底再次出血等严重不良反应，因此具有一定的局限性[47]。在新生血管形成过程中，miR-126对基质蛋白积累和血管通透性方面影响较大，而这些都是引起黄斑水肿而造成患者视力丧失的重要因素[14]。在糖尿病并发创面的研究中，负压创面疗法可上调创面和血浆中miR-126的表达，促进创面的毛细血管修复[10]。而在糖尿病伤口愈合的不同阶段，miRNA对DR血管修复均具有促进效应[48]。血管内皮功能障碍的关键是VECs的衰老。在衰老的血管内皮细胞中HIF-1α和miR-126表达水平均降低，而miR-126的抑制会降低HIF-1α的蛋白表达，说明miR-126/HIF-1α通路可能在其中起到正调节作用[11]。另外，萤光素酶报告系统证明了循环系统miR-126通过调节转录后循环系统组织因子的表达来影响DR脉管系统的止血平衡，进而减少血栓形成而导致的出血[49]。Wang和Yan[50]应用烟酸缓释片治疗DR大鼠，结果显示大鼠视网膜中miR-126表达增加，VEGF/VEGFR、VCAM-1/CD45表达降低，同时细胞凋亡和血视网膜屏障的破坏减少，提示miR-126通路可能参与了烟酸缓释片治疗的正面调节效应。
总体来看，非侵入性、经济有效的循环miR-126可作为DR的新型生物标志物，在早期诊断和鉴别诊断、中期监测和晚期预后评估方面具有巨大的潜在价值，尤其在目前糖尿病大流行背景下，可仅基于血尿样本对糖尿病和DR患者进行大规模筛查，实用意义较大。但是目前miR-126有效的递送系统及其特异性仍然需要深入挖掘，其诊断的稳定性和特异性还有待进一步的大数据研究。
3 小结
细胞内和循环中的miR-126在DR视网膜微血管稳态中的调节、早期诊断、进程监测和治疗等方面的潜在价值受到了极大的关注，但是在这一领域的研究仍有一定局限性。（1）多数报道是以假说为驱动的，仍需要大量的随机对照试验等高级别的临床试验证据加以说明其潜在的临床价值。（2）单一的生物标志物本身对疾病的诊断和预测的敏感性和特异性较差，联合检测几个标志物可以提高对疾病的诊断能力。（3）目前利用miR-126治疗DR还仅限于动物实验研究，而且这些研究的重复性不高。（4）现有的临床研究缺少标准的研究方案，miR-126的水平与微血管损害之间的关系缺少量化标准。（5）目前临床中尚无专门检测miR-126水平的仪器，同时受样本质量和患者本身的影响，结果缺乏可靠性[37, 51]。
但是，随着基因组学的快速发展，通过获取“分子签名”等组学方法可更好的进行生物标记物的研究，miRNA谱及其在眼发育和眼部疾病中的分子机制将会逐渐清晰，未来可能会在个别难治性视网膜疾病的干预中率先获得突破，建立一种新型的miRNA诊疗手段。